Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4 | Следующая страница реферата

Основная часть наших опытов была выполнена на экспериментальной базе Краснодарского НИИ рыбного хозяйства, где нам оказали содействие М.С.Чебанов и Ю.Н.Чмырь.

Мы упоминали уже, что андрогенез привлекает исследователей возможностью получать жизнеспособных особей редких и исчезающих видов. Для этой цели можно использовать межвидовой андрогенез: сохраненной (криоконсервированной) спермой, скажем, исчезающего вида “оплодотворить” яйцеклетки (с “убитыми” ядрами) близкого вида, а затем удвоить набор мужских хромосом. Результатом будут андрогенетические ядерно-цитоплазматические гибриды. Их ядерная ДНК принадлежит отцовскому виду, а митохондриальная - материнскому. Необходимость использовать в андрогенезе яйцеклетки “чужого” вида служит известным ограничением данного метода. Однако нужно учитывать, что по сравнению с ядерным геномом вклад митохондриальных генов в развитие организма невелик.

Белуга, севрюга и андрогенетический гибрид севрюга  белуга.

Для сравнения все они сфотографированы в 10-месячном возрасте.

На жизнеспособности андрогенетических гибридов часто отрицательно сказывается ядерно-цитоплазматическая несовместимость, поскольку нарушаются нормальные взаимодействия между чужеродными друг другу ядром и цитоплазмой [2, 7]. Поэтому, чтобы получить андрогенетических гибридов, необходимо было избежать действия этого фактора.

Мы снова применили уже зарекомендовавший себя в предыдущих опытах метод диспермного андрогенеза. Но теперь родительские пары для “скрещивания” составляли из двух разных видов осетровых рыб (табл.1). Были испытаны комбинации видов как диплоидных, т.е. с относительно малым числом хромосом (около 120), так и тетраплоидных, многохромосомных (240-250 хромосом).

Если родители отличались количеством хромосом, во всех вариантах “скрещиваний” погибали и гаплоидные, и диплоидные гибриды на эмбриональных или ранних постэмбриональных стадиях. Объяснение этому мы увидели в том, что степень ядерно-цитоплазматической несовместимости может зависеть от двух причин: от филогенетической удаленности видов (что очевидно) и от различия в уровне плоидности (количестве гомологичных наборов хромосом) родительских видов [8]. Следовательно, для получения жизнеспособного андрогенетического гибридного потомства больше шансов на успех будет иметь комбинация видов с одинаковым уровнем плоидности. Иначе говоря, следует “скрещивать” между собой или диплоидный вид с диплоидным, или тетраплоидный с тетраплоидным.

Этот вывод подтвердился в дальнейших исследованиях. В тех опытах, в которых использовались яйцеклетки севрюги (Acipenser stellatus) и спермии белуги (Huso huso), мы получили жизнеспособных андрогенетических ядерно-цитоплазматических гибридов. Они живы до сих пор, сейчас им уже шесть лет. Нелишне отметить, что такие гибриды были получены впервые не только для рыб, но и вообще для позвоночных животных. Раньше, еще в 1950-х годах, Б.Л.Астауров вывел андрогенетических гибридов, но не позвоночных, а насекомых - шелкопряда [9].

Чтобы подтвердить наследование гибридами ядерной ДНК от отцовского вида, а митохондриальной от материнского, В.А.Барминцевым с сотрудниками (сектор молекулярной генетики гидробионтов, ВНИРО) был проведен молекулярно-генетический анализ. Как и должно быть, при осеменении севрюжьих яйцеклеток с “убитым” ядром спермой белуги у потомства ядерная ДНК принадлежала белуге, а митохондриальная ДНК, локализованная в цитоплазме и наследуемая по материнской линии, - севрюге. Кроме того, молекулярными методами был подтвержден и диспермный характер происхождения гибридов [6].

Мы получили жизнеспособных андрогенетических гибридов не только от родительской пары “севрюга  белуга”, но и от других видов (с одинаковой плоидностью) осетровых рыб (см. табл.1). Для некоторых из этих гибридов Е.Д.Васильевой (биологический факультет МГУ) был выполнен детальный морфологический анализ. Судя по его результатам, к годовалому возрасту гибриды полностью идентичны по морфологическим признакам отцовскому виду [6].

В ходе экспериментов выяснилось, что не все пары видов с равным числом хромосом могут давать жизнеспособных гибридов. Так, на ранних стадиях останавливалось развитие зародышей от филогенетически близких севрюги и стерляди (A.ruthenus), белуги и шипа (A.nudiventris). Значит, помимо различий в плоидности существуют и другие, пока еще не изученные факторы несовместимости.

Преодолеть ядерно-цитоплазматическую несовместимость мы попытались обходным путем: для андрогенеза использовали яйцеклетки не чистых видов, а обычных межвидовых гибридов и сперму одного из родительских видов [10].

Схема получения андрогенетических межвидовых гибридов с применением гибридной цитоплазмы.

В опыте использованы цветные самцы карпа кои, маркированные рецессивными генами окраски, и серые самки дикого типа, доминантные по соответствующему признаку. Проявление у потомства окрашивания по отцовскому типу надежно подтверждает инактивацию женских ядер и индукцию андрогенетического развития.

Эффективность такого способа мы проверили в экспериментах на костистых рыбах. Оплодотворив спермиями карпа генетически инактивированные яйцеклетки гибридов от скрещивания серебряного карася с карпом и удвоив мужской хромосомный набор (блокированием первого деления дробления), получили жизнеспособных андрогенетических гибридов [10]. Возникшие из гибридных яйцеклеток, они развивались нормально, поскольку отцовское ядро попало в цитоплазму, наполовину состоящую из белков собственного вида. Кстати отметим: прямые андрогенетические гибриды от “скрещивания” облученных яйцеклеток серебряного карася и спермиев карпа, были нежизнеспособны [2].

Все тот же обходной маневр проверен нами и на осетровых рыбах: белуге, стерляди и их плодовитом гибриде - бестере. Но теперь использовались не гибридные яйцеклетки, а гибридная сперма. Надо сказать, из своих опытов мы уже знали, что от “скрещивания” стерляди с белугой выживаемость андрогенетических межвидовых гибридов на эмбриональных стадиях ниже, чем у эмбрионов от внутривидового андрогенеза у стерляди. Когда вместо спермиев белуги использовались спермии бестера, выживаемость андрогенетических зародышей значительно повысилась.

С криоконсервированной спермой

Научившись получать андрогенетических гибридов за счет слияния нативных спермиев, мы попытались использовать вместо них криоконсервированную сперму * [11]. Сложность была в том, что такая сперма обычно уже наполовину разведена растворами криозащитных сред, а наш метод диспермного андрогенеза требует концентрированной спермы. Кроме того, спермии после замораживания и последующего оттаивания могут терять подвижность, из-за чего снижается их оплодотворяющая способность.

* В этой работе участвует также группа криобиологов под руководством Л.И.Цветковой (лаборатория криобиологии Всероссийского НИИ пресноводного рыбного хозяйства).

Тем не менее нам удалось модифицировать методику осеменения облученных яйцеклеток криоконсервированной спермой и осуществить диспермный андрогенез у севрюги (табл.2). Правда, и оплодотворяющая способность замороженной спермы, и выживаемость андрогенетических зародышей оказались ниже, чем в вариантах с использованием нативной спермы. Что касается выживаемости зародышей, то ее низкий уровень, видимо, обусловлен возникновением в спермиях доминантных и (или) рецессивных леталей вследствие заморозки. Мы проследили за развитием выживших андрогенетических севрюжек примерно до трехнедельного возраста и заметили, что их гибель снижалась по мере роста. Таким образом, из криоконсервированной спермы опытным путем был воссоздан генотип азовской севрюги, запасы которой в настоящее время подорваны.

Итак, осуществлен диспермный андрогенез у осетровых рыб с использованием глубокозамороженной спермы. Это подтверждает пригодность метода для воссоздания геномов тех видов, от которых сохранилась только такая сперма.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: bestreferat ru, курсовая работа на тему право.





Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4 | Следующая страница реферата