Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4 | Следующая страница реферата

Авторы сообщили о пересадке ядер клеток внутренней клеточной массы бластоцисты в энуклеированные зиготы мышей и получении трех взрослых мышей (двух самок и самца), генетически идентичных донорской линии мышей. Введение ядер-доноров и удаление пронуклеусов из зиготы проводили за один прием, затем реконструированные яйцеклетки культивировали in vitro до стадии бластоцисты и пересаживали в матку самок. Из 16-ти пересаженных бластоцист три развились во взрослых животных. В следующей работе (1982) эти же авторы использовали в качестве доноров ядер клетки эмбрионов еще более поздних стадий (7 суток) и будто бы получили трех половозрелых мышей. Однако никто из работающих в том же направлении не смог добиться подобных результатов, и достоверность данных Илменси и Хоппе была вновь поставлена под сомнение.

МакГрат и Солтер показали, что ядра 8-клеточных зародышей и клеток внутренней клеточной массы бластоцисты не обеспечивают развитие in vitro реконструированных яйцеклеток даже до стадии морулы, которая предшествует стадии бластоцисты [15]. Небольшая часть (5%) ядер 4-клеточных зародышей дает возможность развиваться только до стадии морулы. В то же время 19% реконструированных яйцеклеток, содержащих ядра 2-клеточных зародышей, смогли достичь стадии морулы или бластоцисты.

Эти и многие другие данные показывают, что в эмбриогенезе у мышей клеточные ядра рано теряют тотипотентность, что связано очевидно, с очень ранней активацией генома зародыша - уже на стадии 2-х клеток. У других млекопитающих, в частности, у кроликов, овец и крупного рогатого скота, активация первой группы генов в эмбриогенезе происходит позднее, на 8-16-клеточной стадии. Возможно поэтому первые значительные успехи в клонировании эмбрионов были достигнуты на других видах млекопитающих, а не на мышах. Тем не менее, работы с мышами, несмотря на их непростую судьбу, значительно расширили наши представления о методологии клонирования млекопитающих.

Кролики, коровы и свиньи

Американские исследонатели Стик и Робл, используя методику МакГрата и Солтера, получили 6 живых кроликов, пересадив ядра 8клеточных эмбрионов одной породы в лишенные ядра яйцеклетки кроликов другой породы [16]. Фенотип родившихся полностью соответствовал фенотипу донора.

Однако только 6 из 164 реконструированных яйцеклеток (3,7%) развились в нормальных животных. Это, конечно, очень низкий выход, практически не позволяющий рассчитывать на получение таким методом клона генетически идентичных животных. Ценность этой работы тем не менее в том. что она показала возможность клонирования эмбрионов кроликов.

Работа с реконструированными яйцеклетками крупных домашних животных, коров или овец, идет несколько по-другому. Их сначала культивируют не in vitro, a in vivo - в перевязанном яйцеводе овцы - промежуточного (первого) реципиента. Затем их оттуда вымывают и трансплантируют в матку окончательного (второго) реципиента - коровы или овцы соответственно, где их развитие происходит до рождения детеныша. Уиладсин предложил заключать реконструированные яйцеклетки в агаровый цилиндр, который он затем трансплантировал в перевязанный яйцевод овцы [17]. По данным одних авторов реконструированные зародыши лучше развиваются в яйцеклетке, чем в культуральной среде, хотя некоторые исследователи получили неплохие результаты и при культивировании.

Американцы Робл и его сотрудники, используя щадящий метод извлечения ядра без прокалывания мембраны яйцеклетки, предложенный МакГратом и Солтером, пересаживали в зиготы так называемые кариопласты - мужской и женский пронуклеусы вместе с окружающей их цитоплазмой, а также ядра 2-, 4- или 8-клеточных эбрионов коровы [18]. Сначала зиготы центрифугировали чтобы освободить пронуклеусы от окружающих их гранул желтка, после чего ядра были хорошо видны под микроскопом (рис. 2а), что значительно облегчало их удаление (рис. 2б). При помощи манипулятора и заостренной стеклянной микропипетки извлекали один из бластомеров вместе с ядром из ранних зародышей (рис. 2в) и переносили его в энуклеированную зиготу (рис. 2г).

Реконструированные зародыши были заключены в агаровый цилиндр и пересажены в перевязанный яйцевод овцы. Через пять дней культивирования их вымывали, освобождали от агара и исследовали. Реконструктурированные зародыши в этой работе развивались только в тех случаях, когда в зиготы пересаживали пронуклеусы: 17% таких зародышей достигли стадии морулы или бластоцисты. Два зародыша были пересажены второму реципиенту - в матку коровы, и развитие их завершилось рождением живых телят. Если в качестве доноров использовали ядра 2-, 4- или 8-клеточных зародышей, то реконструированные яйцеклетки не развивались даже до стадии морулы.

Позже были и более успешные работы. Уиладсин, в частности. сообщил, что ему удалось получить четырех генетически идентичных бычков холстейнской породы в результате пересадки в реципиентные яйцеклетки ядер бластомеров одного 32-клеточного зародыша [19] (рис. 3). Автор утверждал, что большинство ядер сохраняет тотипотентность на 32-клеточной стадии, а значительная их часть даже на 64-клеточной стадии, обеспечивая нормальное развитие реконструированных яйцеклеток до стадии ранней бластоцисты в яйцеводе овцы. После пересадки в матку коров - окончательных реципиентов, как полагает автор, они могут и дальше нормально развиваться.

Бондиоли и соавторы, используя в качестве доноров ядер 16-64-клеточные зародыши коров, трансплантировали 463 реконструированных зародыша в матку синхронизированных реципиентов, и было получено 92 живых теленка [20]. Семь из них были генетически идентичны, представляя собой клон, полученный в результате пересадки ядер клеток одного донорского эмбриона.

Таким образом, клеточные ядра зародышей крупного рогатого скота достаточно долго сохраняют тотипотентность и могут обеспечить полное развитие реконструированных яйцеклеток. Иначе говоря, методические трудности клонирования зародышей крупного рогатого скота практически решены. Но остается основная задача - найти донорские ядра, обладающие тотипотентностью, для клонирования взрослых животных.

Клонированию эмбрионов свиней посвящена только одна небольшая работа [21]. Скудность данных, видимо.и связана с определенными трудностями работы с этим объектом.

Клонирование овец

Уиладсин еще в 1986 году показал, что и у эмбрионов овец на 16-клеточной стадии развития ядра сохраняют тотипотентность [22]. Реконструированные яйцеклетки, содержащие ядра бластомеров 16-клеточных зародышей, развивались нормально до стадии бластоцисты в перевязанном яйцеводе овцы (в агаровом цилиндре), а после освобождения от агара и пересадки в матку овцы - второго реципиента - еще 60 дней. В другом случае донорами служили ядра 8-клеточных зародышей и были получены 3 живых ягненка, фенотип которых соотнетстиовал породе овец - доноров.

В 1989 году Смит и Уилмут трансплантировали ядра клеток 16-клеточного эмбриона и ранней бластоцисты в лишенные ядра неоплодотворенные яйцеклетки овец [23]. В первом случае было получено два живых ягненка, фенотип которых соответствовал породе овец - доноров ядер. Во втором случае один полностью сформировавшийся ягненок погиб во время родов. Его фенотип также соответствовал породе - донору. Авторы считали, что в ходе дифференцировки эмбриональных клеток происходит инактивация некоторых важных для развития генов, в результате которой ядра бластоцисты уже не могут репрограммироваться в цитоплазме яйцеклетки и обеспечить нормальное развитие реконструированного зародыша. Поэтому, по мнению авторов, в качестве доноров ядер лучше использовать 16-клеточные эмбрионы или культивируемые in vitro линии эмбриональных клеток, ядра которых обладают тотипотентностью.

Позднее, в 1993-1995 годах, группа исследователей под руководством Уилмута получила клон овец - 5 идентичных животных, донорами ядер которых была культура эмбриональных клеток [24]. Клеточную культуру получали следующим образом: выделяли микрохирургически эмбриональный диск из 9-дневного овечьего эмбриона (бластоцисты) и культивировали клетки in vitro в течение многих пассажей (по крайней мере до 25). Сначала клеточная культура напоминала культуру стволовых недифференцированных эмбриональных клеток, но вскоре, после 2-3-х пассажей, клетки становились уплотненными и морфологически сходными с эпителиальными. Эта линия клеток из 9-дневного зародыша овцы была обозначена как TNT4.

Чтобы донорское ядро и реципиентная цитоплазма находились на сходных стадиях клеточного цикла, останавливали деление культивируемых клеток TNT4 на определенной стадии (GO) и ядра этих клеток пересаживали в энуклеированные яйцеклетки (соответственно на стадии метафазы II). Реконструированные эмбрионы заключали в агар и трансплантировали в перевязанные яйцеводы овец. Через 6 дней эмбрионы вымывали из яйцевода первого реципиента и исследовали под микроскопом. Отбирали те, которые достигли стадии морулы или бластоцисты и пересаживали их в матку овцы - окончательного реципиента, где развитие продолжалось до рождения. Родилось 5 ягнят (самок) из них 2 погибли вскоре после рождения, 3-й в возрасте 10 дней, а 2 оставшихся нормально развивались и достигли 8-9-месячного возраста. Фенотипически все ягнята были сходны с породой овец, от которой получали исходную линию клеток TNT4. Это подтвердил и генетический анализ.

Эта работа, особенно в части культуры эмбриональных клеток, - значительное достижение в клонировании млекопитающих, хотя она и не вызвала столь шумного интереса, как статья того же Уилмута с соавторами, опубликованная в начале 1997 года, где сообщалось, что в результате использования донорского ядра клетки молочной железы овцы было получено клональное животное - овца по кличке Долли [25]. Последняя работа методически во многом повторяет предыдущее исследование 1996 года, но в ней ученые использовали не только эмбриональные, но еще и фибробластоподобные клетки (фибробласты - клетки соединительной ткани) плода и клетки молочной железы взрослой овцы. Клетки молочной железы получали от шестилетней овцы породы финн дорcет, находящейся на последнем триместре беременности. Все три типа клеточных культур имели одинаковое число хромосом - 54, как обычно у овец. Эмбриональные клетки использовали в качестве доноров ядер на 7-9-м пассажах культивирования, фибробластоподобные клетки плода - на 4-6-м пассажах и клетки молочной железы - на 3-6-м пассажах. Деление клеток всех трех типов останавливали на стадии GO и ядра клеток пересаживали в энуклеированные ооциты (яйцеклетки) на стадии метафазы II. Большинство реконструированных эмбрионов сначала культивировали в перевязанном яйцеводе овцы, но некоторые и in vitro в химически определенной среде. Коэффициент выхода морул или бластоцист при культивировании in vitro в одной серии опытов был даже вдвое выше, чем при культивировании в яйцеводе. (Поэтому, видимо, нет строки необходимости в промежуточном реципиенте и можно обойтись культивированием in vitro. Однако для полной уверенности в этом нужны дополнительные данные.)

Выход морул или бластоцист в серии опытов с культурой клеток молочной железы был примерно втрое меньше, чем в двух других сериях, когда в качестве доноров ядер использовали культуру фибробластов плода или эмбриональных клеток. Число живых ягнят в сравнении с числом пересаженных в матку окончательного реципиента морул или бластоцист было также в два раза ниже. В серии опытов с клетками молочной железы из 277 реконструированных яйцеклеток был получен только один живой ягненок, что говорит об очень низкой результативности такого рода экспериментов (0,36%). Анализ генетических маркеров всех семи родившихся в трех сериях экспериментов живых детенышей показал, что клетки молочной железы были донорами ядер для одного, фибробласты плода - для двух и эмбриональные клетки - четырех ягнят. Овца по кличке Долли развилась из реконструированной яйцеклетки, донором ядра которой была культивируемая клетка молочной железы овцы породы финн дорсет и фенотипически не отличается от овец этой породы, но сильно отличается от овцы-реципиента. Анализ генетических маркеров подтвердил этот результат.

Успех авторов этой работы прежде всего связан с использованием длительных клеточных культур, так как после многих пассажей в культуре клеток могли быть отобраны малодифференцированные стволовые клетки, которые, вероятно, и были использованы как доноры ядер. Большое значение также имел тот факт, что авторы, учитывая результаты своих предыдущих работ, синхронизировали стадии клеточного цикла яйцеклеток реципиентов и клеток доноров.

Заключение

Итак, работы по клонированию позвоночных были начаты на амфибиях в начале 50-х годов и интенсивно продолжаются вот уже более четырех десятилетий. Что касается амфибий, то, как было сказано в соответствующем разделе, несмотря на значительные достижения, проблема клонирования взрослых особей остается до сих пор не решенной. Установлено, что в ходе клеточной дифференцировки у позвоночных происходит или потеря определенных генных локусов или их необратимая инактивация. Судя по всему, утрачивается та часть генома, которая контролирует не ранние, а более поздние этапы онтогенеза, в частности, метаморфоз амфибий. Механизм этого явления пока не поддается научному объяснению. Но очевидно, что для клонирования взрослых позвоночных необходимо использовать малодифференцированные делящиеся клетки. Это методически важное положение было учтено в более поздних работах.

В 1979 году американский биолог МакКиннел, внесший большой вклад в работу с амфибиями, утверждал, что полученные результаты не позволяют серьерно говорить о возможности клонирования человека [26] - тогда это казалось недоступным для экспериментальных эмбриологов. Однако еще в то время многие ученые, писатели и даже политики стали активно обсуждать возможностт клонирования человека, а некоторые исследователи даже приступили к таким экспериментам. Например, Шеттлз сообщил, что пересадил ядро сперматогониальной клетки (диплоидного предшественника зрелого гаплоидного спермия) в лишенную ядра яйцеклетку человека [27]. В результате три реконструированные яйцеклетки начали дробление, и возникли похожие на морулы скопления клеток, которые позднее деградировали. Шеттлз полагал, что если трансплантировать такие группы клеток в матку женщины, то они могли бы нормально развиваться. МакКиннел тогда справедливо возразил, что такое предположение маловероятно и совершенно необоснованно.

Еще 5-6 лет назад никто из ученых, а их работало довольно много в этой области, не ставил вопрос об использовании в качестве доноров ядер клеток взрослых млекопитающих. Работы сводились, в основном, к клонированию эмбрионов домашних животных, и многие из этих исследований были не очень успешны. Поэтому так поразило появившееся в начале 1997 года неожиданное для всех сообщение авторского коллектива под руководством Уилмута, что им удалось, используя соматические клетки взрослых животных, получить клональное животное - овцу по кличке Долли. На самом деле, однако, исследователи прошли долгий путь, и Уилмуту с сотрудниками пришлось собрать воедино все существовавшие к тому времени достижения, прежде чем они смогли сообщить о сенсационном результате своей работы.

У этого первого успешного эксперимента есть существенный недостаток - очень низкий коэффициент выхода живых особей (0,36%), и если учесть также высокий процент гибели развивающихся реконструированных яйцеклеток в плодный период развития (62%), который в 10 раз выше, чем при обычном скрещивании (6%), то встает вопрос о причинах гибели зародышей. Все ли пересаженные донорские ядра обладали тотипотентностью? Сохранялся ли полностью их функциональный геном (набор генов, необходимых для развития), все ли нужные для развития гены были дерепрессированы? Это очень важные вопросы, и по одному животному нельзя сделать окончательные выводы. Тем более, что результаты исследований на амфибиях говорят о необратимом характере инактивации, репрессии генов в ходе клеточной дифференцировки. Возможно, авторам крупно повезло, и они достаточно случайно в трех разных клеточных популяциях отобрали за короткий срок стволовые клетки, для которых характерна низкая дифференцированность и способность к делению. Чтобы подтвердить результат этой, в буквальном смысле слова с.енсационной работы, необходимы дополнительные исследования.

В ближайшие годы главная задача исследователей, работающих в данной области - это, по-видимому, создание культивируемых in vitro линий малодифференцированных стволовых клеток, характеризующихся высокой скоростью деления. Ядра именно таких клеток должны обеспечить полное и нормальное развитие реконструированных яйцеклеток, формирование не только морфологических признаков, но и нормальных функциональных характеристик клонированного организма.

Исследования Уилмута и сотрудников имеют не только практическое, но и большое научное значение для генетики развития. В сущности, они нашли условия, при которых цитоплазма ооцитов млекопитающих может репрограммировать ядро соматической клетки, возвращая ей тотипотентность. После публикации этой работы сразу и широко стал дискутироваться вопрос о возможности клонирования человека. Чтобы его обсуждать, имеет смысл выделить два аспекта: методический и этический.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: реферат металлы, виды шпор.





Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4 | Следующая страница реферата