Вступ.......................................1
1. Огляд лiтератури
1.1 Iсторiя дослiджень......................3
1.2 Загальна характеристика лейкоцитiв......6
1.3 Характеристика Т- i В-лiмфоцитiв........9
1.4 дiя iонiзуючого випромiнювання на
Т-клiтинний iмунiтет....................13
1.5 Дiя iонiзуючого випромiнювання на
органiзм людини.........................17
2. Матерiали i методи дослiдження
2.1 Характеристика обстежених груп..........20
2.2 Методика визначення субпопуляцiй
Т-лiмфоцитiв............................22
2.3 Методика пiдрахування числа
лейкоцитiв вкровi.......................24
2.4 Методика визначення диференцiйованоi
формули лейкоцитiв......................25
2.5 Визначення рiвня CD3+,CD4+,CD5+,CD8+.
лiмфоцитiв у периферичнiй кровi.........28
2.6 Статистична обробка даних...............29
3. Стан клiтинного iмунiтету у
практиноздорових студентiв ЧДУ..........30
4. Стан клiтинного iмунiтету у осiб,
що проживають в зонi посиленого
радiацiйного контролю...................33
5. Висновки....................................42
Лiтература..................................43


__ ВСТУП

АКТУАЛЬНIСТЬ РОБОТИ

На даний час вважасться доведеним, що сильна або тривала дiя
ряду неспецифiчних факторiв навколишнього середовища може призво-
дити до порушень клiтинного iмунiтету [ ]
Значне мiсце серед цих факторiв займас iонiзуюче вип-
ромiнювання. Встановлено, що гостра дiя радiацii призводить до
порушень в кiстковому мозку та тимусi.
Наслiдком цих змiн с зниження iмунноi вiдповiдi органiзму за
рахунок спiввiдношень лiмфоцитарних субпопуляцiй.
Iонiзуюче випромiнювання може викликати безлiч морфо-
логiчних i функцiональних змiн iзсторони iмунноi системи людини.
Порушення функцiй iмунноi системи можуть бути причиною ви-
никнення ряду захворювань: аутоiмунний тиреозит, бронхолегеневi
захворювання, виникнення добро-та злоякiсних пухлин i iн.
Враження iмунокомпетентних клiтин веде до формування вторин-
ного iмунодефiциту, структура i вираженiсть якого залежить вiд
характеру та дози випромiнювання, а також вихiдного функцiо-
нального стану опромiненого органiзму, та ступенi ураження ор-
ганiв, що обумовлюють функцii iжмунноi системи.
Патогеннi змiни функцii iмунноi системи, iх проявлення дас
змогу профiлактики та вчасному лiкуванню тих захворювань в пато-
генезi яких лежить порушення iмунного гомеостазу.
Це робить питання дослiдження впливу iонiзуючого випромiню-
вання на iмунну систему актуальним.
_" МЕТОЮ__ дипломноi роботи с вивчення вiддаленоi дii аварii на
ЧАЕС на клiтинний iмунiтет населення Украiни.
_" ЗАДАЧI__ якi ставилися для досягнення цiсi мети:
1. Вивчити експресii Т-поверхневих клiтинних маркерiв у меш-
канцiв радiацiйно-незабруднених районiв Украiни.
2. Вивчення модифiкацii Т-лiмфоцитарних рецепторiв у сту-
дентiв, що зазнали впливу малих доз радiацii внаслiдок аварii на
ЧАЕС
3. Порiвняльний аналiз впливу малих доз радiацii на Т-клiтин-
ний iмунiтет студентiв рiзних факультетiв ЧДУ.



__ НАУКОВА НОВИЗНА
Вперше дослiджено вплив на iмунiтет дii комбiнованого
iунiзуючого випромiнювання.

__ ПРАКТИЧНЕ ЗНАЧЕННЯ РОБОТИ
Дипломна робота виконана в рамках теми, що викладасться в
ЧДУ по замовленню Мiнiстерства Освiти Украiни "Вплив малих доз
радiацii на клiтинний iмунiтет".
__


1. Огляд лiтератури.

1.1. Iсторiя дослiджень.

Проблема впливу iонiзуючого випромiнення на органiзм людини
i тварин с однiю з найважливiших в екологiчнiй медицинi, почина-
ючи з 40-х рокiв нашого сторiччя.
В березнi 1954 року на дослiдницькому полiгонi ( Маршаловi
острови, США) було проведено вибух термоядерноi бомби з експери-
ментальною метою. В результатi вибуху мало мiсце осадження радi-
оактивних речовин на населених аттолах.Проведенi дослiдження по-
казали, що в районах випадання радiоактивних речовин була висока
радiоактивна забрудненiсть. Значне число осiб як серед мiсцевого
населення, так i серед учасникiв дослiджень одержали радiацiйнi
враження в тiй чи iншiй мiрi.
В результатi дослiджень за потерпiлими були зiбранi цiннi
вiдомостi, що висвiтлюють деякi аспекти дii iонiзуючоi радiацii
на людину. Початковi данi були доповненi повторними спостережен-
нями через 6 та 24 мiсяцi з моменту враження. На основi порiвня-
ння одержаних результатiв iз наявними даними про враження людей
у Хiросiмi та Нагасакi, а також матерiалами, одержаними при не-
щасних випадках у лабораторiях та при експериментах iз тваринами
було зроблено спробу встановити гранично допустиму дозу випромi-
нення для людини.
Було доведено, що -випромiнення найбiльш небезпечне в рай-
онi випадання осадiв, воно с проникаючим iйого вплив може викли-
кати таке ж гостре променеве враження, яке спостерiгалось у япо-
нцiв у Хiросiмi та Нагасакi. Опромiнення шкiри -променями небе-
зпене i при вiдсутностi -випромiнення. Незважаючи на те,що шкi-
рне враження iнодi з'являсться пiзно, воно може привести до тяж-
ких наслiдкiв.
У осiб, що зазнали дii радiоактивних осадiв, може спостерi-
гатися внутрiшнс забруднення радiоактивними речовинами.Кiлькiсть
радiоактивних речовин, депонованих у кiстковiй тканинi, виявила-
ся невеликою i не викликала гостроi реакцii. Вважали, що вражен-
ня, якi розвиваються при цьому, нетривалi i нетяжкi,особливо як-
що прийняти мiри захисту проти надмiрного вдихання радiоактивних
матерiалiв. Основними проблемами медичного контролю в мiсцях ви-
падання радiоактивних осадiв вважали питання,пов'язанi з загаль-
ним - та -опромiненням шкiри [
матерiалiв. Основними проблемами медичного контролю в мiсцях ви-
падання радiоактивних осадiв вважали питання,пов'язанi з загаль-
ним - та -опромiненням шкiри [
Особливо цiкаву групу дослiджень склали лабораторнi тести
по впливу iонiзуючого випромiнення на стан iмунноi системи та фу-
нкцiональну здатнiсть ii складових. Так, дослiди по вивченню ран-
нiх Т-клiтин продемонстрували статистично-достовiрне вiково-зале-
жне пiдвищення рiвня CD3-4+(8-) -лiмфоцитiв у периферичнiй кровi
потерпiлих. Але загальний рiвень Т-клiтин знижувався, можливо,
внаслiдок вiково-специфiчноi деградацii Т-клiтинних функцiй. Чи-
сло натуральних кiллерiв (НК) та клiтин-попередникiв цитотоксич-
ноi активностi значно пiдвищувалося у старих людей, що зазнали
впливу радiацii.
Було також встановлено, що щорiчне збiльшення середньоi час-
тоти соматичних мутацiй в опромiненого населення на одну величину
бiльше в Т-клiтинному рецепторному комплексi та в HLA-A2 [ ]
Як бачимо, наведенi дослiдження продемонстрували, що один з
найбiльш яскравих ефектiв впливу радiацii на органiзм людини ха-
рактерний саме для iмунноi системи. Пiдтвердженням цьому стали
дослiдження, проведенi пiсля аварii на Чорнобильськiй АЕС.
У результатi катастрофи на ЧАЕС виникло радiоактивне забру-
днення мiсцевостi не лише на територii Cвропи, але й за ii межа-
ми - в США, Китаi та Японii [ ]
В умовах радiоактивного забруднення основне дозове наванта-
ження формують радiонуклiди, що потрапляють в органiзм людини з
харчовими продуктами, iстотно впливаючи на стан здоров'я населен-
ня. Аварiя на ЧАЕС призвела до виникнення безпрецендентного для
мирного часу становища, коли об'сктом дii малих доз iонiзуючоi
радiацii стали багатотисячнi контингенти населення.
Оскiльки до спектра пов'язаних iз Чорнобильською катастро-
фою радiонуклiдiв входять довгоживучi радiоiзотопи, очевидно, що
ситуацiя, яка виникла, значною мiрою визначатиме стан здоров'я
населення Украiни принаймi у найближчiй iсторичнiй перспективi.
Все це вимагас детального вивчення наслiдкiв опромiнення малими
дозами iонiзуючоi радiацii фiзiологiчних систем органiзму люди-
ни. Серед останнiх важливе мiсце знову ж таки належить iмуннiй
системi, оскiлькивона с рiвноправною ланкою нейроiмуноендокрин-
ного регуляторного контуру, порушення з боку якого вiдiграють ви-
значну роль у патогенезi найпоширенiших хронiчних захворювань
(атеросклероз, злоякiснi новоутвори, дiабет, аутоiмуннi процеси
та iн.) [ ]
Слiд мати на увазi, що на вiдмiну вiд iнших фiзiологiчних
систем, визначення показникiв iмунiтету, як правило, проводить-
ся в статичному режимi, а не в режимi функцiональних наванта-
жень, що обмежус можливiсть судження про функцiональний резерв
тестованоi системи, який визначас в кiнцевому рахунку ii адап-
тивнi можливостi.
Любченко П.Н. з спiвавт. (1990) вiдмiчають, що при впливi
iонiзуючоi радiацii вражасться перш за все клiтинний iмунiтет
(антигенрозпiзнаюча ланка) [ ]


1.2 ЗАГАЛЬНА ХАРАКТЕРИСТИКА ЛЕЙКОЦИТIВ

Лiмфоiднi клiтини, з якими зв'язанi всi iмуннi механiзми,
з'являються, дозрiвають та функцiонують в рiзних органах.
В них знаходяться клiтини з обмеженим транспортом в органiзмi, а
також багаточисельнi рециркулюючi клiтини.
До клiтин iмунноi системи вiдносять лiмфоцити: агранулоцити -
В- i Т-лiмфоцити (незернистi лейкоцити). Лейкоцити вiдносять до
бiлих кров'яних клiтин. В них с ядро i цитоплазма. Значне число
лейкоцитiв в кровi дорослоi людини - в 1 мкл 6-8 тис. Однак iх
чисельнiсть може змiнюватись вiд часу доби, функцiонального ста-
ну органiзму. Розрiзняють фiзiологiчний i реактивний лейкоцитоз
(збiльшення числа лейкоцитiв).
Перший частiше спостерiгасться пiсля вживання iжi, пiд час
вагiтностi при м'язевiй роботi, сильних емоцiях, вiдчуттi болю.
Другий вид характерний для запальних процесiв та iнфекцiйних
захворювань.
Фiзiологiчний лейкоцитоз по своiй природi являсться перероз-
подiльним.
Реактивний лейкоцитоз обмовлений пiдвищенням викиду iз органiв
кровоутворення клiтин i пероеважно молодих. В цьому приймас
участь кiстковий мозок, легенi, селезiнка [ ]
Лейкопенiя - (зменшення кiлькостi лейкоцитiв) характеризус
протiкання деяких iнфекцiйних захворювань. Спостерiгасться в ос-
таннi роки неiнфекцiйна лейкопенiя, пов'язана головним чином з
пiдвищеннямрадiацiйного фону. Особливо гострою вона бувас при уш-
кодженнi кёсткового мозку в результатi опромiнення [ ]
Кiлькiсне спiввiдношення рiзних видiв лейкоцитiв периферичноi
кровi називають лейкоцитарною формулою. Вiдхилення лейкоцитарноi
формули являсться важливим дiагностичним показником при рiзно-
манiтних захворюваннях [ ] В нормi вона являс слiдуюче
спiввiдношення в % [ ]:
базофiли 0 - 1
еозинофiли 0,5 - 5
паличкоядернi нейтрофiли 1 - 6
сегментоядернi нейтрофiли 47 - 72
лiмфоцити 19 - 37
моноцити 3 - 11

Всi види лейкоцитiв володiють амебоiдною рухливiстюидкiсть ру-
ху може досягати до 40 мкм/хв.
При наявностi певних хiмiчних подразникiв лейкоцити можуть
виходити через ендотелiй капiлярiв i спрямовуватись до подразни-
ка, мiкробiв клiтин, якi розпадаються чужородного тiла або ком-
плексу антиген-антитiло. По вiдношенню до них лейкоцити во-
лодiють позитивним хемотаксисом. Свосю цитоплазмою лейкоцити
здатнi оточити чужородне тiло i за допомогою спецiальних фер-
ментiв перетравлювати його (фагоцитоз).
Один лейкоцит може захопити 15-20 бактерiальних клiтин (моно-
цит). У лейкоцитах мiститься цiлий ряд ферментiв пептидази,(лiпа-
зи...).В звичайному станi ферменти знаходяться в лiзосомах -
iзольовано. Лейкоцити здатнi адсорбувати деякi речовини i перено-
сити iх на своiй поверхнi.
Бiльше 50% всiх лейкоцитиi розмiщусться за межею судинного
русла - гiстоцити, 30% у кiстковому мозку. По вiдношенню до лей-
коцитiв кров виконус транспортну функцiю, доставляючи iх вiд
мiсця утворення до рiзних органiв[ ]
В залежностi вiд того, мiстить цитоплазма зернистiсть чи во-
на однорiдна, лейкоцити дiлять на 2 групи гранулоцити i агрануло-
цити[ ]Гранулоцити становлять 60% всих лейкоцитiв кровi, час iх
життя приблизно 2 доби.
Гранулоцити подiляють на види:
1. Еозинофiли - гранули яких забарвлюються кислими фарбами (в
рожевий колiр);
2.Базофiли - основними фарбами (синiй колiр)
3.Нейтрофiли - здатнi сприймати тi i другi фарби (розово-фiо-
летовий колiр).
Збiльшення числа еозинофiлiв - еозинофiлiя, виникас при
алергiчнiй реакцii, при цьому в органiзмi утворюються антитiла
проти власних клiтин [ ]
На мембранi базофiлiв с рецептори до яких присднуються певнi
глобулiни плазми кровi. Так утворюсться iмунний комплекс. Iз гра-
нул звiльнясться гiстимiн, який викликас розширення судин, спазм
бронхiв, свербiж.
Нейтрофiли в залежностi вiд вiку мають ядро рiзноi форми
(полiморфоядернi): у юних - ядро кругле; у молодих - у виглядi
палички; зрiлi - сегментоядернi. З вiком ядро клiтин перешнуро-
вусться i роздiлясться на декiлька сегментiв [ ]
Нейтрофiли с найбiльшважливими елементами неспецифiчного за-
хисту системи кровi, якi здатнi знешкоджувати навiть такi чуже-
роднi тiла з якими органiзм ранiше не зустрiчався. Вони накопи-
чуються в мiсцях пошкодження тканин або проникнення мiкроро-
ганiзмiв, захоплюють i перетравлюють iх. Нейтрофiли адсорбують
аьо видiляють на поверхнiмембран антитiла проти мiкробiв i чу-
жерiдних бiлкiв. I таким чином нейтрофiли теж забеспечують iмун-
ний механiзм захисту.
Агранулоцити (незернистi лейкоцити) подiляють:
1. Моноцити
2. Лiмфоцити
Моноцити - самi великi клiтини кровi, вони мають округлу фор-
му i добре виражену цитоплазму. Моноцити також здатнi до аме-
боiдного руху i характеризуються самою високою фагоцитарною ак-
тивнiстю.


1.3 ХАРАКТЕРИСТИКА Т- I В-ЛIМФОЦИТIВ

В залежностi вiд функцiональних властивостей розрiзняють 2
основнi класи лiмфоцитiв: Т- та В-клiтини.
Тимусозалежнi лiмфоцити (Т-лiмфоцити), в свою чергу, утво-
рюють ряд пiдкласiв. Однi з них забезпечують виконання регулято-
рних функцiй, зокрема, можуть "допомагати" ( "хелпери" ) чи "по-
давляти" ("супресори") розвиток iмунноi вiдповiдi, в тому числi
утворення антитiл. Iншi виконують ефекторнi функцii, наприклад,
виробляють розчиннi реовини, якi сприяють виникненню реакцiй за-
палення або здiйснюють пряме руйнування клiтин, що несуть на со-
бi антигени.
Таким чином, видiляють Т-хелпери, Т-супресори, Т-кiллери та
Т-клiтини реакцiй сповiльненоi гiперчутливостi.
Т-лiмфоцити утворюються з стволових клiтин кровотворних тка-
нин i проходять стадiю дозрiвання в тимусi. До цього часу остаточ-
но не вирiшили, один чи рiзнi попередники для хелперних, супре-
сорних та цитотоксичних клiтин. С вiдомостi, що тiмоцити мозковоi
зони належать до iншого ряду диференцiювання, нiж тiмоцити кiрко-
воi зони. Вiдомо також, що основну масу клiтин тимусу складають
субпопуляцii CD4-8-, CD4+8+, CD4+8-, CD4-8+ (подвiйнi негативнi,
подвiйнi позитивнi, одинарнi позитивнi клiтини).
Подвiйнi негативнi - незрiлi (immature), CD4-8- переважають
у тимусi ембрiонiв. Iх кiлькiсть зростас при регенерацii тимусу
пiсля опромiнення. По властивостям i фенотипу вони близькi до кi-
стково-мозкових попередникiв тiмоцитiв. Цi клiтини, що несуть
CD5 -антиген (CD4-8-5+), забезпечують генерацiю 3-х основних суб-
популяцiй тiмоцитiв (CD4+8+,CD4+8-,CD4-8+).
Подвiйнi позитивнi клiтини вважаються незрiлими i нездатними
до подальшого дозрiвання, вони приреченi на загибель у тимусi.
Одинарнi позитивнi клiтини - майже зрiлi,але не iдентичнi пе-
риферичним Т-клiтинам.
Лiмфоцити периферичноi кровi належать до клiтин з комплекс-
ним типом антигенноi специфiчностi. Вони здатнi розпiзнавати од-
ночасно продукти власних МНС-генiв (гени головного комплексу гiс-
тосумiсностi) та чужорiднi антигени. Головний комплекс гiстосумi-
сностi - основна генетична система, що визначас функцiонування
мунноi системи, i, перш за все, Т-системи iмунiтету. Видiляють 2
групи молекул головного комплексу гiстосумiсностi - молекули МНС
класу I та молекули МНС класу II.
Молекули МНС класу I - мембраннi глiкопротеiни,виявленi бук-
вально в усих клiтинах. У людини 3 локуси, що кодують молекули
класу I - HLA-A, HLA-B, HLA-C.
Молекули класу I визначають специфiчнiсть впiзнавання мiшенi
алогенними клiтинами-кiллерами i розпiзнаються разом з вiрусами,
пухлинними та iншими мембранними антигенами цитотоксичними Т-клi-
тинами.
Молекули МНС класу II (у людини HLA-Dr та HLA-Dc) вiдiграють
головну роль у стимуляцii пролiферацii алогенних Т-клiтин,що скла-
дас основу iмунноi вiдповiдi у змiшанiй культурi лiмфоцитiв. Роз-
пiзнаються Т-хелперами та iншими Lyt 1+ -клiтинами, що виробляють
IЛ-2 для посилення цитотоксичноi активностi [ ].
Розглянемо окремi пiдкласи Т-клiтин.
Т-хелпери (iндуктори). Iснус три типи цих клiтин. Перший -
iмфоцити, що впiзнають елементи головного комплексу гiстосумiс-
ностi. Вони мають специфiчнiсть до антигенiв, зв'язаних iз влас-
ними Iа-бiлками. Цi лiмфоцити iндукують пролiферацiю В-клiтин i
iх диференцiювання до антитiл-утворюючих клiтин. Другу групу скла-
дають Т-хелпери, що впiзнають iмуноглобулiни. Вони володiють спе-
цифiчнiстю як до антигену, так i до власних iзотопiчних детермi-
нант. Активують В-клiтини, що мають такi ж детермiнанти. Третя
група Т-хелперiв секретус лiмфокiнiн (IЛ-2). Вони впiзнають анти-
ген у комплексi з власними Ia-детермiнантами.
Регуляторна функцiя Т-хелперiв полягас в здатностi стимулю-
вати В-клiтини до пролiферацii i диференцiацii в антитiлоутворюючi
клiтини. Вiдповiдь В-клiтини на бiльшiсть бiлкових антигенiв пов-
нiстю залежить вiд допомоги Т-клiтин. Такi антигени - тимусозалеж-
нi.
Допомога Т-хелперiв здiйснюсться двома способами. Перший -
пряма взасмодiя Т-хелпера i реагуючоi В-клiтини (когнантна допомо-
га). У цьому випадку Т-клiтина розпiзнас детермiнанти антигенноi
молекули, уже фiксованоi на В-клiтинi. Також розпiзнаеться продукт
МНС-гена на поверхнi В-клiтини (МНС класу II). Другий спосiб поля-
гас в утвореннi розчинних неспецифiчних хелперних факторiв - лiм-
фокiнiнiв. Це обидва фактори росту (в першу чергу фактор, що регу-
люс пролiферацiю В-клiтин i вiдповiдь на антигенну стимуляцiю).
Одна й та ж Т-клiтина може здiснювати хелперну функцiю як на
основi когнантноi взаемодii, так i з допомогою медiатора. Деякi
Т-клiтини вiдiграють роль пiдсилювача хелперноi дii. Вони дiють на
вже стимульованi В-клiтини.
Т-супресори складають групу клiтин, якi здатнi пригнiчувати
iмунну вiдповiдь. Т-супресори дiють, регулюючи чисельнiсть Т-хел-
перiв. Прямий вплив цих клiтин на В-лiмфоцити вивчений недостатньо.
Супресорна система включас три клiтиннi форми. Форма Ts 1 спе-
цифiчна до антигену i виробляе фактор TsF 1. Вiн активус Ts 2, cпе-
цифiчний проти iдiотипiв антитiл до антигену, зв'язаного Ts 1.
TsF 2 активус клiтину TsF 3, яка супресорно дiс на хелпернi Т-клi-
тини.
Iснують також Т-контрсупресорнi клiтини (з фенотипом Ly 1).Во-
ни запобiгають iнактивацii Т-хелперiв супресорними клiтинами. Вiдi-
грають важливу роль для розвитку iмунологiчноi толерантностi при
активнiй супресii.
T-цитотоксичнi клiтини несуть маркери, схожi iз супресорними
клiтинами (Lyt 2).Вони лiзують клiтини, що несуть на поверхнi ан-
тигени, до яких специфiчнi данi лiмфоцити.
Перша стадiя лiзису - розпiзнавання антигену i молекул кла-
су I на поверхнi клiтини-мiшенi. Далi йде руйнування цiсi клiтини.
Т-цитотоксичнi клiтини можуть брати участь в декiлькох циклах лi-
зису, самi при цьому не руйнуючись. Iх називають ще Т-кiллерами.
Кiллернi клiтини вiдiграють важливу роль в захистi вiд вiрусних
захворювань та в протипухлинному iмунiтетi.
Особливу групу складають природнi кiллери (ПК). Вони здатнi
вбивати деякi види пухлинних клiтин, використовуючи зовсiм iншi
способи розпiзнавання, нiж Т- i В-лiмфоцити [ ].
Iснують данi про рiзноманiтну радiочутливiсть популяцiй i
субпопуляцiй лiмфоцитiв: найбiльш радiочутливими вважаються Т-су-
пресори, а найбiльш радiорезистентними - Т-хелпери [ ]
Проте деякi автори вважають, що вiдмiнностi в радiочутливо-
стi в умовах in vivo можуть бути обумовленi якимись певними фак-
торами, можливо навiть рiзними пропорцiйними спiввiдношеннями
окремих лiмфоцитних субпопуляцiй. Тому N. Nakamura з спiвавтора-
ми (1990) оцiнили вiдповiдь кожноi субпопуляцii Т-лiмфоцитiв на
iонiзуюче випромiнення в умовах in vitro. Дослiдники використали
методику клонування Т-клiтин у присутностi фактору росту iнтер-
лейкiну-2 (IL-2). Дослiдження показали, що фракцiя колонiй лiм-
фоцитiв CD4+ становила 30-50% вiд загальноi кiлькостi клiтин i
фракцiя колонiй CD8+ - 15-20%. Взагалi, бiльше 97% сортованих
клiтин несли на своiй поверхнi CD4 чи СD8 -поверхневi антигени.
Доза опромiнення не перевищувала 5 Гр, оскiльки при бiльшiй дозi
клiтини гинуть.
Результати чiтко продемонстрували, що радiочутливiсть CD4+
i CD8+ -лiмфоцитiв дуже схожа. Аналiз колонiй несортованих лiм-
фоцитiв показав, що вони несуть поверхневi маркери CD4- i CD8-
(тобто, не мають хелперних чи супресорних властивостей). Хоча не
було точно визначено, чи присутнiй на них маркер дорослих лiмфо-
цитiв CD3, вченi вирiшили, що бiльшiсть iз них - натуральнi кiл-
лери. Виявилося, що радiочутливiсть цих клiтин також не вiдрiз-
нясться вiд радiочутливостi CD4+ чи CD8+. N.Nakamura робить вис-
новок, що в умовах in vitro гiпотеза про найбiльшу радiочутли-
вiсть Т-супресорiв не пiдтверджусться. Можливо, в цих умовах пе-
реважну бiльшiсть клiтин з поверхневим антигеном CD8 складають
тi, що не виконують супресорних функцiй [ ]


1.4 ДIЯ IОНIЗУЮЧОГО ВИПРОМIНЮВАННЯ НА Т-КЛIТИННИЙ IМУНIТЕТ

Як же реагують попередники Т-лiмфоцитiв на iонiзуючче опромi-
нення? Вплив радiацii на iмунну систему (зокрема, ii тимусозалежну
ланку) вивчений недостатньо. Т.Ю.Харченко зi спiвавт. (1994) прове-
ли дослiдження на мишах, здiйснивши опромiнення в перiод органоге-
незу. Закладка i формування тимусу мишей проходить на 7-12 добу ро-
звитку ембрiону. Саме в цей перiод органiзм найбiльш чутливий до
дii iонiзуючого опромiнення, його результатом може бути спотворен-
ня або загибель новонароджених.
На 9-ту добу ембрiонального розвитку мишей закладасться стро-
ма тимусу, на 13-ту - закiнчусться перша хвиля заселення тимусу
лiмфоiдними попередниками, проходить формування кiркового i мозко-
вого шарiв тимусу, здiйснюсться перебудова генiв - i -ланцюгiв
рецептора Т-клiтин для Thy-антигену. До 17-i доби завершусться пе-
ребудова генiв клiтинного рецептору, проходить його експресiя на
поверхнi тiмоцитiв, формуються основнi субпопуляцii СD4-8-,CD4+8+,
CD4-8+, CD4+8- -тiмоцитiв. З цими ж термiнами пов'язана друга
хвиля заселення тимусу клiтинами-попередниками Т-лiмфоцитiв.
В цi критичнi термiни розвитку тимусу опромiнювали вагiтних
самок з наступним дослiдженням вмiсту i популяцiйного складу клi-
тин тимусу i селезiнки. Дози опромiнення варiювали вiд 0,15 до
4 Гр. Аналiз проводили в першу добу i через 2 тижнi пiсля народже-
ння. При опромiненнi на 9-й день вагiтностi плiд гинув при дозi
0,5 Гр, на 13-ту добу - при дозi 0,7 Гр, при опромiненнi на 17-ту
добу доза 0,15-4 Гр не перешкоджала вагiтностi i пологам.
Виявилося, що при дозi радiацii, меншiй 1 Гр, значних змiн у
клiтинностi тимусу немас. А при дозах 0,15 i 0,3 Гр спостерiгасть-
ся навiть пiдвищення клiтинностi. Опромiнення в дозах 1, 2 i 4 Гр
на 17-ту добу розвитку приводить до зниження клiтинностi тимусу i
селезiнки, доза в 1 Гр на 13-ту добу - до зниження клiтинностi ли-
ше в селезiнцi. Можливо, тiмоцити в цей перiод бiльш резистентнi,
нiж в пiзнiшi термiни. Справдi, на 13-ту добу розвитку 100% тiмо-
цитiв складають СD4-8- -попередники Т-клiтин, яким властива до-
сить висока радiорезистентнiсть.
Данi свiдчать про вищу радiорезистентнiсть тiмоцитiв 17-ти до-
бового плоду, нiж тiмоцитiв дорослих мишей. Очевидно, i в цьому ви-
падку мова йде про рiзне спiввiдношення субпопуляцiй тiмоцитiв, що
вiдрiзняються в радiочутливостi. Дiйсно, вмiст радiорезистентних
CD4-8- -клiтин складас в цей перiод 40%, тодi як у дорослих мишей
3-5%.
I все ж у опромiнених в ембрiональний перiод мишей сплостерi-
гасться вiдставання в клiтинностi тимусу, яке при дозi менше 1 Гр
лiквiдусться на 30-ту добу (пiсля цього клiтиннiсть навiть вища,
нiж у неопромiнених). При дозi бiльше 2 Гр вiдставання залишасться
i пiд кiнець мiсяця. Для клiтин селезiнки характернi глибшi змiни,
якi не лiквiдуються до 30-i доби життя. Зате при опромiненнi в до-
рослому вiцi клiтиннiсть тимусу швидше вiдновлюсться у мишей, якi
були опромiненi у перiод внутрiшньоутробного розвитку.
Вмiст у тимусi i селезiнцi Thy 1+, CD4+ та CD8+ -клiтин прак-
тично не вiдрiзнясться по вiдносному складу вiд контролю (опромi-
нення проведене на 14-ту добу вагiтностi, оцiнка стану - через 14
дiб пiсля народження). Вченi роблять висновок, що описанi вище
змiни у вмiстi тiмоцитiв в результатi опромiнення зумовленi дiсю
радiацii переважно на юнi тiмоцити, без iстотного впливу на послi-
дуючу диференцiацiю клiтин-попередникiв, що вижили, i дивергенцiю
субпопуляцiй [ ]
Звичайно вважають, що враження лiмфоiдних популяцiй тимусу с
результатом виключно пошкоджуючоi дii iонiзуючого опромiнення як
такого.В той же час с багато доказiв стресорного ефекту опромiнен-
ня i можливостi спустошення тимусу i розвитку лiмфопенii в резуль-
татi пiдвищення сироваточного рiвня кортикостероiдiв, зумовленого
стресом.
М.П.Савiна та А.А.Ярилiн (1994) провели дослiдження, в якому
намагалися виявити, чи впливас на клiтиннiсть тимусу локальне оп-
ромiнення гiпоталамуса, гонад, селезiнки та стегна. Експеримент
проведено на мишах. Доза радiацii варiювала вiд 1 до 10 Гр. Аналiз
проводився через 1 добу, 1, 3 та 12 мiсяцiв пiсля опромiнення.Вия-
вилося,що при локальному опромiненнi будб-якого органу клiтиннiсть
тимусу знижувалася. Проте,термiни нормалiзацii числа тiмоцитiв бу-
ли рiзними. При опромiненнi стегна та cелезiнки рiвень Т-клiтин
вiдновлювався через добу; гонад - до кiнця першого року. При опро-
мiненнi самого тимусу (10 Гр) зниження рiвня тiмоцитiв вiдмiчало-
ся на протязi всього перiоду спостережень. Вченi роблять висновок,
що в формуваннi пiзнього Т-клiтинного дефiциту вiдiграс роль не
лише опромiнення тимусу, але й стабiльнi ендокриннi порушення пiс-
ля опромiнення гiпоталамуса та гонад (але не селезiнки та стегна).
При локальному радiацiйному впливi на тимус (1 ; 10 Гр), гiпотала-
мус, гонади, селезiнку та стегно (10 Гр) раннс спустошення тимусу
може бути викликане як безпосередньою дiсю опромiнення на орган,
так i пiдвищенням рiвня гормонiв - медiаторiв стресовоi реакцii
при дii радiацii на iншi органи [ ]
Деякi автори вважають, що iонiзуюче опромiнення в малих до-
зах може здiйснювати стимулюючий вплив на органiзм iз збiльшенням
маси тiла, середньоi тривалостi життя, пiдвищенням стiйкостi до
рiзних несприятливих впливiв i iнфекцiй завдяки активацii iмунних
реакцiй. Хоча пов'язанi з цим дослiдження проводилися на тваринах,
клiтиннi механiзми згаданих ефектiв до цього часу практично не ви-
вченi. Н.А.Слiсесва зi спiвавторами ( 1994 ) дослiдили механiзми
стимулюючоi дii малих доз опромiнення на iмунiтет, зокрема, на
бласттрансформацiю лiмфоцитiв кровi пацюкiв по критерiю включення
Н-тимiдину в ДНК. Причому перевiряли як самостiйний вплив опромi-
нення, так i його ефект на фонi стимуляцii мiтогеном. В якостi мi-
тогену брали Конканавалiн А. Мiтоген вносили в культуру за 10 хв
до опромiнення. Дози варiювали вiд 1 до 6 сГр. Дослiдники вiдмiти-
ли велику рiзноманiтнiсть чутливостi тварин до мiтогену (в залеж-
ностi вiд цього iх роздiлили на 3 групи). Можливо, причина цього -
рiзноманiтнiсть у початковому вмiстi лiмфобластiв у кровi рiзних
тварин та в рiзнiй початковiй чутливостi рецепторiв лiмфоцитiв до
мiтогену. Результати дослiджень показали вiдсутнiсть стимуляцii
лiмфоiдноi пролiферацii при опромiненнi без мiтогену i посилення
бласттрансформацii при опромiненнi в дозах 0,09-6 сГр на фонi
Кон А (при сумарнiй дозi 12 сГр рiвень знижувався до контролю).
Тобто, опромiнення само по собi не с стимулятором пролiферацii лi-
мфоцитiв кровi, але в сполученнi з мiтогеном здатна посилювати йо-
го стимулюючий вплив на клiтини iмунноi системи [
I.М.Бiляков зi спiвавторами висунув думку про iснування "сти-
мулюючих доз", при яких в культурi з'являюься ростовi фактори
Т-клiтин. Вони провели дослiдження впливу -опромiнення у новона-
роджених мишей на пролiферативну активнiсть камбiального епiтелiю
в культурi стромальних клiтин тимусу. Виявилося, що опромiнення в
момент висiву культури послаблюс пролiферацiю клiтин в логарифмiч-
нiй фазi росту. Пiсля 2 дiб культурування опромiнення в дозах 10 i
20 Гр подавляло пролiферацiю ендотелiальних клiтин (ЕК) тимусу.Але
доза 15 Гр викликала посилення пролiферативноi активностi. Якщо
оцiнка результатiв проводилася через 48 годин культурування (а не
через 24, як у першому випадку) посилення пролiферацii спостерiга-
лося при дозах 5, 8 i 15 Гр. При 10 Гр - iнгiбiцiя, пiсля 20 Гр -
послаблення пролiферацii.
Вченi припускають,що "стимулюючi дози" змiнюють iнтенсивнiсть
мiжклiтинних контактiв ЕК з iншими клiтинами строми тимусу. Цей
обмiн проходить повiльно, тому наслiдки пошкоджень можуть прояви-
тися на рiвнi цiлого органiзму вiдносно пiзно. В кiнцевому резуль-
татi цi пошкоджуючi ефекти радiацii на ЕК тимусу повиннi вiдобра-
зитися на вмiстi в стромi тимусу епiтелiальних клiтин, iх функцiо-
нальнiй активностi, ефективностi процесу розвитку Т-лiмфоцитiв.
Очевидно, наслiдками саме таких змiн с заресстрованi прояви Т-клi-
тинного iмунодефiциту у осiб, що зазнали впливу факторiв аварii на
ЧАЕС через 5 рокiв пiсля iх дii.
Взагалi, дослiдження Бiлякова показали,що ефект радiацii про-
являсться в посиленнi подiлу Т-клiтин, якi без опромiнення перехо-
дять в стан спокою, тобто стають бiльш зрiлими, функцiонуючими
клiтинами [


1.5 ДIЯ IОНIЗУЮЧОГО ВИПРОМIНЮВАННЯ НА ОРГАНIЗМ ЛЮДИНИ.

Р.В.Петров зi спiвавт. (1994) вiдмiчають, що для iмунноi сис-
теми характерна висока мобiльнiсть, пов'язана з тим, що всi ii го-
ловнi компоненти практично завжди знаходяться в активованому (робо-
чому) станi i певний рiвень активацii, мабуть, с нормальним станом
iмунноi системи. Пiд впливом антигенних та неантигенних проявiв
(якими може виступати iонiзуюча радiацiя), що безперервно поступа-
ють у внутрiшнс середовище органiзму, iмунна система постiйно змi-
нюс свiй облiк, рiвнi своiх складових частин (Т-хелперiв, Т-супре-
сорiв, Т-контрсупресорiв i т.д.). При виникненнi реакцii на зов-
нiшнiй вплив iмунна система буде "збурена" до того часу, доки не
перейде в новий рiвноважний стан. Цей стан зберiгасться до того ча-
су,доки iнший стимул не поступить зовнi або не виникне в органiзмi.
Якщо антигеннi стимули проникають в органiзм неперервно, очевидно,
iмунна система безперервно буде змiнюватися i знаходитися в русi.
У свiтлi концепцii iмунологiчних мобiлiв по новому виникас питан-
ня про нормативнi параметри iмунноi системи. Наприклад, пiдви-
щення рiвня клiтин-хелперiв ще нiчого не означас, коли не вистачас
макрофагiв. Навпаки, мале число помiчникiв може бути iдеальним,ко-
ли немас супресорiв [ ]
Першi ж дослiдження стану iмуноi системи у людей, що приймали
участь у лiквiдацii наслiдкiв аварii на ЧАЕС продемонстрували пору-
шення в клiтиннiй ланцi iмунiтету. Вмiст Т-загальних лiмфоцитiв
був знижений, Т-активних - пiдвищений. Зниження кiлькостi Т-лiмфо-
цитiв спостерiгалося у 57% обстежених, пiдвищення числа Т-активних
- у 75% обстежених.Враховуючи вiдмiнностi в дозi опромiнення осiб,
що працювали в 1986 i 1987 рр., було проаналiзовано матерiал у за-
лежностi вiд часу перебування в Чорнобилi. Любченко П.Н. зi спiв-
авторами (1990) встановили, що кiлькiсть Т-клiтин у тих,хто працю-
вав у Чорнобилi в 1986 i 1987 рр., iстотно не вiдрiзнялася i була
достовiрно нижчою, нiж у контролi. Кiлькiсть Т-клiтин, що активно
утворювали розетки, у осiб, що працювали в 1987 роцi, була досто-
вiрно нижчою, нiж у тих, що працювали в 1986 роцi, але перевищува-
ла рiвень в контрольнiй групi [ ] Любченко вiдзначас, що хоча iс-
нус думка про швидке вiдновлення складу лiмфоцитiв вже до кiнця
другого мiсяця, с докази повiльного вiдновлення кiлькостi саме Т-
лiмфоцитiв. Його послiдуючi дослiдження показали, що у осiб, якi
приймали участь у лiквiдацii наслiдкiв аварii на ЧАЕС i якi працю-
вали в Чорнобилi в 1986 роцi, навiть через 5-5,5 рр. вiдмiчалися
нерiзко вираженi, але стiйкi порушення клiтинного iмунiтету.Причо-
му сильнiше страждас субпопуляцiя CD4+ -хелперiв, формування яких
залежить вiд тимусу, нiж CD8+ -супресорiв [ ]
В.С.Смiрнов зi спiвавт. (1990) проводили дослiдження населен-
ня, яке зазнало впливу факторiв аварii на ЧАЕС через 2 роки пiсля
катастрофи. У потерпiлих було виявлено iстотне пiдвищення вiднос-
ного та абсолютного числа Т5+ -лiмфоцитiв, в основному за рахунок
Т8+ -субпопуляцiй. Але достовiрне зниження вiдносного вмiсту Ea-
РОК i пригнiчення лiмфокiноутворюючоi активностi Т-лiмфоцитiв свiд-
чить про те, що функцiональна активнicть Т3+ -лiмфоцитiв була си-
льно пригнiчена. Можливо, певну роль в депресii iмунних реакцiй
вiдiгравали активованi Т-супресори. Таким чином, дослiдження стану
iмунiтету у людей, що зазнали впливу радiацii в дозах 0,2-0,5 Гр
пiд час аврii на ЧАЕС показали, що iмунологiчнi порушення, якi ви-
никли при цьому, можуть зберiгатися протягом 2 рокiв пiсля опромi-
нення. Було зроблено припущення, що нестабiльнiсть iмунного стату-
су зумовлена порушеннями генетичного апарату клiтини, що проявля-
ються в конформацiйних змiнах ссДНК. Глибина зниження функцiональ-
ноi активностi i змiн спiввiдношення субпопуляцiй лiмфоцитiв зна-
ходиться у прямiй залежностi вiд ступеня деспiралiзацii ссДНК (ра-
дiацiйно обумовлена деспiралiзацiя ДНК лiмфоцитiв супроводжусться
пригнiченням, а пiдвищена суперспiралiзацiя - нормалiзацiсю бiль-
шостi реакцiй iмунноi системи) [ ]
Змiни у станi Т-клiтинного iмунiтету були виявленi не лише у
лiквiдаторiв аварii на ЧАЕС, але й у мешканцiв радiацiйно забруд-
нених районiв. Так, О.Ф.Мельников зi спiавт. (1993) дослiлили стан
iмунноi системи у мiстi Кисвi за першi 4 роки пiсля катастрофи.
Проведенi дослiдження засвiдчили, що протягом першого року пiсля
аварii найбiльш вираженi змiни визначалися з боку НЦК (натуральних
цитотоксичних клiтин) та К-кiллерiв, якi вiдiграють важливу роль у
реалiзацii протипухлинного та противiрусного iмунiтету. Функцiона-
льна активнiсть цих клiтин була рiзко знижена. Значно менш вираже-
ний характер мали змiни з боку Т-лiмфоцитiв периферичноi кровi об-
стежених, котрi проявилися в основному тенденцiсю до зниження за-
гального вмiсту Т-клiтин (CD3+) та вiдносного числа Т-ефекторiв
(CD4+ -хелперiв), що призвело до загального зниження у них iндексу
iмунореактивностi (CD4+/CD8+).
Виявлене в 1987 роцi значне зниження цитолiтичноi активностi
НЦК продовжувало збiльшуватися в 1988 та 1989 рр., у 1990 роцi рi-
вень цитолiтичноi активностi К-кiллерiв периферичноi кровi обсте-
жених значною мiрою вiдновився, тодi як функцiональна активнiсть
НЦК зростала набагато повiльнiше, досягаючи в середньому 9,4%, що
iстотно нижче контрольних значень. Триваюче пiдвищення рiвня акти-
вностi К-клiтин у 1991 роцi, мабуть, можна розглядати як часткову
компенсацiю цитотоксичноi функцii, що певною мiрою не реалiзува-
лася НЦК, функцiональна активнiсть яких мало змiнилася порiвняно з
1990 роком. Вмiст лiмфоцитiв периферичноi кровi до 1990 р. набли-
зився до контрольного значення [ ]
У випадку жителiв мiста Кисва можна говорити про вплив малих
доз радiацii.
Взагалi, згiдно iснуючих уявлень, малими вважаються дози iо-
нiзуючого опромiнення, що переважають природний радiацiйний фон
(ПРФ) бiльше, нiж у 10 разiв. Вiдносно людини, така доза складас
0,04-0,05 Гр при тривалому опромiненнi. НКДАР ООН рекомендус вва-
жати малими дози, що перевищують ПРФ у 10-100 разiв. Результати
дослiджень впливу низьких рiвнiв iонiзуючого випромiнення на здо-
ров'я людей дозволяс визначити бiологiчну ефективнiсть всiх форм
променевоi дii, починаючи з рiвнiв ПРФ. При оцiнцi малих доз опро-
мiнення МКРЗ при ООН виходить iз того, що будь-яка доза, вiдмiнна
вiд нуля, с канцерогенною та генетично небезпечною.
Як уже вiдмiчалося, одним iз наслiдкiв аварii на ЧАЕС с три-
вале опромiнення населення малими дозами радiацii за рахунок про-
никнення в органiзм радiоактивних речовин, що забруднюють продук-
ти харчування. При цьому характерний повiльний розвиток патологi-
чних процесiв [ ]
Дослiдження, проведенi на пацюках i мишах, показали, що три-
вале введення малих доз окису тритiю (180 дiб) приводить до стiй-
кого спустошення стволового кровотворного пула, яке зберiгасться
до кiнця життя. Незворотне скорочення кiлькостi полiпотентних по-
передникiв Т-клiтин вiдмiчалося i пiсля тривалого зовнiшнього -
-опромiнення. Спостерiгалися значнi порушення Т-лiмфопоезу, не
вiдновлювалися популяцii зрiлих, функцiонально-активних лiмфоци-
тiв. Iмунодефiцитний стан формувався в результатi стiйкоi гiпопла-
зii лiмфоiдноi тканини. Причому гiпоплазiя тимусу та лiмфатичних
вiддiлiв виражена сильнiше, нiж у селезiнцi i кiстковому моз-
ку [


2. МАТЕРIАЛИ I МЕТОДИ ДОСЛIДЖЕННЯ.

2.1 ХАРАКТЕРИСТИКА ОБСТЕЖЕНИХ ГРУП.

Обстеження проводилися на практично здорових волонтерах,
що навчаються в Черкаському державному унiверситетi на фа-
культетах фiзвиховання та природничому факультетi.
Показники клiтинного iмунiтету у практично здорових во-
лонтерiв студентiв факультету фiзичного виховання та студен-
тiв природничого факультету розглядалися як контрольнi
дослiдження. Для проведення iмунологiчних обстежень на кож-
ного волонтера заповнюсться карта iндивiдуального обстежен-
ня, розроблена в Республiканському центрi iмунологiчних дос-
лiджень.
В контрольну групу вiдбиралися волонтери-чоловiки, що
вiдповiдали слiдуючим критерiям:
-вiсутнiсть професiйних шкiдливостей;
-вiдсутнiсть побутових шкiдливостей (контакт з нiтрофарбами,
гербiцидами, пестицидами);
-вiдсутнiсть перенесених iнфекцiйних захворювань, травм,
опiкiв;
-вiдсутнiсть в анемнезi: хiмiкотерапii (цитостатиками, гор-
мональними препаратами, iмунодепресантами i iмуностимулято-
рами) та променевоi терапii;
-iмунологiчно не обтяжений сiмейний анемнез;
-вiдсутнiсть клiнiчних ознак iмунологiчноi недостачi;
-вiдсутнiсть хронiчних захворювань.
Карта iндивiдуального iмунологiчного обстеження запов-
нювалась в двух екземплярах: один направлявся в Республiкан-
ський центр iмунологii, другий залишався на кафедрi фiзiо-
логii iз подальшим занотуванням на комп'ютерi IВМ РС/ХТ 286
в iмунологiчнiй лабораторii.
До дослiдних груп належали студенти факультету фiзично-
го виховання та студенти природничого факультету, котрi заз-
нали дii малих доз iонiзуючоi радiацii, проживаючи у зонiпо-
ситленого радiацiйного контролю (4-та зона).
До проведення iмунологiчного обстеження на пiддос-
лiдних заповнювалися карти iндивiдуального iмунологiчного
обстеження.
Для проведення дослiдiв по змiнi показникiв клiтинного
iмунiтету в периферичнiй кровi обстеженню пiдлягали слiдуючi
групи:
1-ша група - практично здоровi волонтери, що навчаються на
4-му курсi факультету фiзвиховання ЧДУ;
2-га група - практично здоровi волонтери, щонавчаються на
4-му курсi природничого факультету ЧДУ;
3-тя група - особи, що проживають в зонi посиленого
радiацiйного контролю та навчаються на 4-му
курсi факультету фiзвиховання ЧДУ;
4-та група - особи, що проживають в зонi посиленого
радiацiйного контролю та навчаються на 4-му
курсi природничого факультету ЧДУ;


2.2 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ СУБПОПУЛЯЦIЙ Т-ЛIМФОЦИТIВ
У ВЕНОЗНIЙ КРОВI З ВИКОРИСТАННЯМ МОНОКЛОНАЛЬНИХ
СИВОРОТОК
Специфiчнi антитiла зв'язуються з мембранними антигена-
ми живих клiтин, що знаходяться у суспензii. Щоб запобiгти
келiнгу i iндингу (злущуванню) антигенiв пiсля взасмодii з
антитiлами, до суспензii клiтин добавляють 0.2%-й азид нат-
рiю. У прямих методах IФА використовують специфiчнi до
клiтинних антигенiв антитiла, коньюгуючi з флуорисцентною
мiткою. А маркування клiтин проводять як одноетапну реакцiю.
У непрямих методах IФА в якостi антитiл використовують
не мiченi антитiла до клiтинних антигенiв, а в якостi дру-
гих - мiченi флуорохромом антитiла до iмуноглобулiнiв. Мар-
кування клiтин проводять у два етапи.
Другi антитiла служать для виявлення зв'язаних з клiти-
ною перших антитiл.
Непрямi методи, як правило, чутливiшi прямих.
1. Венозну кров (7 мл) з антикоагулянтом (9.8% цитрат нат-
рiю 0.5 мл, або 25 од/мл гепарина) розбавлясмо фосфатним
буфером у спiввiдношеннi 1:1.
Склад фосфатного буферу:
КН РО 1,15 г.

Na HPO 0,2 г.

КСl 0,2 г.

NaCl 8 г.
на 1мл. дистильованоi води

До фосфатного буферу додасмо 2 г. сироватки альбумiнiв
кролика.
2. На свiжоприготовлений одноступеневий фiкол-верографiно-
вий градiснт (2 мл.) нашаровусмо за допомогою пiпетки з
грушею розбавлену ФБ (фосфатним буфером) кров у центри-
фужнiй пробiрцi.
Методика виготовлення фiкол-верографiна.
24,4 г. фiколу-400 розчиняють у теплiй дистильованiй
водi. Змiшують з 49,9 мл. 70% розчину верографiну. До-
водять об'см до 340 мл. Температура зберiгання розчину
+8 С.
3. Пробiрки з градiснтом кровi центрифугусмо протягом
20-25 хв.
4. Вiдбирасмо пiпеткою з грушею середнiй опалесцуючий
шар,що мiстить лiмфоцити у окремi пробiрки.
5. Вiдмивасмо популяцiю лiмфоциту вiд залишкiв градiснта
фосфатним буфером двiчi, за допомогою центрифугування
протягом 10 хв. Декантусмо. Вiдмивку повторюсмо 2 рази.
6. Доводимо концентрацiю мононуклеарних клiтин за допомо-
гою розведення ФБ до рiвня 1-5 х 10 кл./мл.
Контроль концентраццii проводимо вкамерi Горясва (в од-
ному великому квадратi повинно мiститись 20 лiмфатич-
них клiтин).
7. До 50 мкл одержаних клiтин добавлясмо мiкропiпеткою по
5 мкл. антисироватки LT3 - для визначення кiлькостi
зрiлих Т-клiтин у венознiй кровi (CD3), LT1 - для
зрiлих i майже зрiлих Т-лiмфоцитiв (CD5), LT4 - для
визначення Т-хелперiв (CD4), LT8 - для визначення
Т-супресорiв (CD8).
8. Iнкубусмо сумiш лiмфоцитiв з антисиворотками протягом
20-25 хв при кiмнатнiй температурi.
9. Вiдмивасмо мононуклеари вiд залишкiв не зв'язаноi АС.
Для цього у кожну пробiрку доливасмо по 2 мл ФБ з кро-
лячим альбумiном (2.5%) i центрифугусмо протягом 10
хв. Вiдмивку повторюсмо двiчi. 10. До 50 мкл отриманоi
сумiшi добавляемо по 5 мкл ФIТЦ. Iнкубусмо 20-25 хв.
11. Проводимо вiдмивку вiд флуоресцуючих антитiл мононук-
леари. Вiдмивку проводимо аналогiчно вiдмивцi вiд анти-
сивороток тричi. 12. Мононуклеари за допомогою пiпетки
наносимо на предметне скельце. 13. Скельця помiщасмо на
пiдставки у чашки Петрi з розчином формалiну i фiксус-
мо препарат у його парах на протязi 10 хв. 14. Зафiксо-
ваний препарат пiдсушують при кiмнатнiй темпера -
турi.Готовi препарати зберiгаються у холодильнiй камерi
протягом 3-х дiб. 15. Аналiз препаратiв. Пiдрахунок
проводиться шляхом перерахунку % флуоресцуючих клiтин
на 100 клiтин проглянутих у препаратi. Мiкроскопують за
допомогою мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою,
окуляр-7, об'сктив-90. У якостi iмерсii використовус-
ться водний розчин глiцерину.


2.3. МЕТОДИКА ПIДРАХУНКУ ЧИСЛА ЛЕЙКОЦИТIВ В КРОВI

1. Палець протерти ватою змоченою 70% розчином спитту.
2. Одноразовим стерильним скарифiкатором проколоти
палець.
3. Першу краплю кровi зтерти ватою змоченою спиртом.
4. Декiлька крапель кровi з пальця витиснути на пред-
метне скло.
5. Капiляром Салi 0,02 мл. кровi перенести в центри-
фужну пробiрку з 0,4мл. 3% розчину оцтовоi кислоти.
6. Легким посту куванням по пробiрцi перемiшати вмiст
i залишити пробiрку для руйнування еритроцитiв.
7. Притерти покривне скло до камери Горясва таким чи-
ном, щоб з'явилися Ньютоновi кiльця.
8. Пiдрахувати кiлькiсть клiтин в 25 великих квадра-
тах камери Горясва.
9. Одержаний результат перерахувати за формулою:
Х 10/20, де Х - кiлькiсть клiтин в 25 великих
квадратах.

Нормальна кiлькiсть лейкоцитiв у дорослоi людини коливас-
ться в межах 4500-10000 в 1 куб.мм.


2.4 МЕТОДИКА ВИЗНАЧЕННЯ ДИФЕНРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ
ЛЕЙКОЦИТIВ.

Визначення загальноi кiлькостi бiлих кров'яних тiлець,
дас уяву проiх абсолютну кiлькiсть. Але не дас вiдомостей
про процентне спiввiдношення (диференцiйовану формулу) мiж
рiзними видами лейкоцитiв i про якiснi змiни в iх морфологii
при хворобливих станах.
Визначення диференцiйованоi формули проводиться на фар-
бованому мазку кровi.
Диференцiйована формула характерно змiнгюсться при рядi
хворобливих станiв i мас надзвичайно важливе дiагностичне i
прогностичне значення.
Нормальна диференцiйована формула дорослоi людини нас-
тупна:
молодi нейтрофiльнi клiжтини - 0%
паличкоядернi нейтрофiльнi клiтини - 0-4%
сегментоядернi нейтрофiльнi клiтини - 55-70%
лiмфоцити - 20-40%
моноцити - 2-6%
еозинофiльнi клiтини - 1-4%
базофiльнi клiтини - 0-1%
плазматичнi клiтини - 0-5%

ВИГОТОВЛЕННЯ МАЗКА КРОВI.
1.Необхiдною умовою для правильного пiдрахунку морфо-
логiчних особивостей кров'яних клiтин являсться вда-
лозроблений i добре забарвлений кров'яний мазок.
Добре зроблений мазок кровi повинен вiдповiдати наступ-
ним умовам:

а) починасться на 1 см. вiд вузького краю предметного
скла i закiнчусться на 2-3 см. вiд його другого краю.
Загальна довжина мазка повинна охоплювати 1/2 - 3/4
скла.
б) мазок повине бути рiвномiрноi товщини, а не хвили-
подiбний. Правельний мазок кровi товщий на початку, поступо-
во тоншас i закiнчусться у виглядi слiду, мов би залишеного
тонкою щiточкою.
в) мазок повинен бути вiдокремленим вiд краю.
Шар кровi не повинен доходити до другогоь краю скла.
Приготування мазкiв проводиться слiдуючим чином: пред-
метне скло, на якому буде зроблено мазок, беруть за один
кiнець великим i вказiвним пальцями правоi руки. Другий
кiнець, вiдступаючи на 1 см. вiд краю, обережно дотикасться
до свiжоiкраплi капiлярноi кровiiз пальця, нi в якому разi
не торкаючись шкiри в мiсцi проколу. Крапля кровi перехо-
дить на скло, вона повинна мати дiаметр 2-3 мм.
Предметне скло перекладають у лiву руку взявши його ве-
ликим вказiвним i середнiм пальцямитак, щоб крапля знаходил
ась зверху на предметному склi, з боку вказiвного i серед-
нього пальцiв.
Шлiфоване скло, яким буде зроблено мазок вставлясться
пiд кутом 40-45 на 1-2 мм перд краплею, придержуючи великим
i вказiвним пальцями правоi руки край шлiфованого скла i
обидва краi предметного скла. Шлiфоване скло рухають назад
так, щоб воно торкалося кровi i крапля поширювалася в кутi
мiж шлiфованим i предметним склом. потiм швидким рухом ру-
хаючи скло в зв оротньому напрямку роблять мазок.
Протягом того часу коли робиться мазок, великий iвказiвний
пальцi правоi руки ковзають по краях предметного скла i тим
створюють необхiдну опору для накладання шару кровi.

ФАРБУВАННЯ КРОВ'ЯНОГО МАЗКА.
Для якiсного дослiдження морфологii кров'яних клiтин-
фарбування кров'яного мазка мас важливе значення. Основу су-
часного фарбування кров'яних клiтин поклав петербуржський
лiкар Д.Л.Романовсьий. В 1891 роцi вiн запропонував свiй
барвник. В 1902 роцi Гiмза вдосконалив барвник Романовського.
Барвник Романовського-Гiмза складасться з лужноi i кис-
лоi частини. Лужна частина - азур 2, А кисла частина - еозин.
Азур 2 забарвлений в яскраво-синiй колiр, а еозин в роже-
во-червоний.
Щоб приготувати основний розчин барвника розчиняють 30
г. азуру 2-еозину i 0,8г. азуру 2 в 250 мл. глiцерину, наг-
рiваючи прицьому 90-120 хв. при 50 С, а потiм додають 250мл.
чистого метилового спирту. Пiсля вiдстоювання протягом 1-7
днiв при кiмнатнiй температурi фiльтрують.

ФIКСАЦIЯ КРОВ'ЯНОГО МАЗКА.
Перед фарбуванням мазок кровi фiльтрують. Це робиться
для денатурацii бiлкiв у клiтинах, при збереженнi iхжиттсвоi
структури iж для закрiплення клiтин на предметному склi. Для
фiксацii використовусться абсолютний метиловий алкоголь. Час
фiксацii - 3-5 хв.
Перед роботою ,пiсля фiксацii, препарат заливають робо-
чим розчином (розведеним) барвника Романовського-Гiмза. I
залишають на 20-40 хв. Потiм його промивають, сушать, див-
ляться пiд мiкроскопом.


ПIДРАХУНОК ДИФЕРЕНЦIЙОВАНОI ФОРМУЛИ.
Кров'янi клiтини не розподiляються рiвномiрно повсьому
препратi.На початку i в кiнцi мазка вiдкладасться бiльшiсть
великих клiтин з малою питомою вагою (моноцити,
гранулоцити), а в серединi - бiльшiсть малих клiтин, з вели-
кою питомою вагою (лiмфоцити). Порiвняно найбiльш правильне
спiввiдношення складасться на дiлянках показаних на малюнку:

????????????????????????????????????????
? ? ??? ? ? ??? ? ?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
? ??? ??? ??? ??? ?
? ?
? ??? ??? ??? ??? ?
? ? ? ? ? ? ? ? ? ?
? ? ??? ? ? ??? ? ?
????????????????????????????????????????

Тому саме на них проводиться диференцiйований пiдрахунок
кров'яних тiлець. Пiдрахунок робиться у виглядi меандрiв,
щоб уникнути повторення одних i тих же клiтин.
Пiдраховують не менше 25 клiтин (краще по 100) в 4-х
дiлянках вказаних на малюнку. РЕзультат виражають в %.
Замiсть 4-х малих меандрiв, можна без грубоi помилки,
описати 2 великих меандри, тобто злити 2 малих поля вiдцен-
тру з обох сторiн в одне велике, не роблячи розриву в сере-
динi. В такому разi в кожному з обох великих полiв пiдрахо-
вують мiнiмально по 50 клiтин (краще по 100) i результат ви-
ражають в %. Для полегшення розрахункiв використовують еле-
ментарнi механiчнi лiчильнi машини.


2.5 ВИЗНАЧЕННЯ РIВНЯ CD3+,CD4+,CD5+,CD8+ ЛIМФОЦИТIВ У
ПЕРИФЕРИЧНIЙ КРОВI.
1.Кров брали стерильно з лiктьовоi вени вранцi, до вжи-
вання iжi. Лiмфоцити видiляли з гепаринiзованоi кровi цен-
трифугуванням на градiснтi Фiкол-Вiрографiну (густина 1,077
г/мл).
2.1-0,1 млн. лiмфоцитiв в об'смi 50 мкл. вносили в цен-
трифужнi пробiрки i до клiтин додавали 5 мкл. моноклонально-
го антитiла CD8 i iнкубували 30-45 хв. при +4 С.
3.Додавали 150 мкл. розчину Хенкса i центрифугували 5
хв. при g 200.
4.Вилучали супернатант. Потiм вносили 50 мкл. розчину
Хенкса, клiтини суспендували, додавали 150 мкл. розчину Хен-
кса i центрифугували 5 хв. при g 200.
5.Вилучали супернатант. До осаду вiдмитих клiтин дода-
вали 50 мкл. F(ab)2-Фрагментiв овечих антитiл до Ig мишi,
помiчених ФIТЦ i розбавлиних 1:100. Для розведення викорис-
товували фiзрозчин, забуферений фосфатом (РВS), що мiстиь
0,5% желатину i 0,5% азиду натрiю. Клiтини суспензували i
iнкубували 30 хв. при 4 С.
6.Клiтини 2 рази вiдмивали як указано в п.п.3-4.
7.Пiсля остаточного видалення супернатанту клiтини ви-
носили на предметне скельце i помiщали в пари формалiну для
фiксацii на 10-1 хв. Мiченi клiтини аналiзували з допомогою
мiкроскопу з люмiнiсцентною насадкою ЛН-30МС. Статистичну
обробку матерiалiв проводили звикористанням методики Андрю-
щенко.


2.6 СТАТИСТИЧНА ОБРОБКА ДАНИХ

Одержанi цифровi результати були обробленi методом
варiацiйноi статистики по Стьюденту за допомогою програми
складеноi аспiрантом кафедри алгебри Андрущенко. Оскiльки
програма написана на мовi Ассемблер, то датиii ропечатку не-
мас можливостi, а тому нижче наводиться, як приклад, ре-
зультат обробки даних цiсю програмою.


Розрахунок основних характеристик вибiрки
--------------------------------------
Скачали данный реферат: Грета, Darjushin, Паллидия, Innokentij, Ивазов, Аким.
Последние просмотренные рефераты на тему: контрольные работы 8 класс, задачи реферата курсовые работы, решебник 6 класс виленкин, конспект урока 9 класс.





1