Методы разделения иммуноглобулинов

| Категория реферата: Рефераты по химии
| Теги реферата: сочинение почему, диплом о высшем образовании
| Добавил(а) на сайт: Gribkov.

К холодной сыворотке крови добавляют равный объем холодного 2,78 М раствора сульфата аммония, перемешивают при 40С 2 ч. Сладок растворяют в изотоническом растворе хлорида натрия и осаждают еще 2 раза. При этом 2,78
М раствором сульфата аммония в основном осаждаются иммуноглобулины класса
G. Причем , такая концентрация соли осаждает IgG2 и , что очень важно, наиболее полно IgG1 при минимальном осаждении фракций (- и (- глобулинов. Поэтому данный метод наиболее удобен для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 как из сыворотки крови лошадей, так и овец и крупного рогатого скота.

ОСАЖДЕНИЕ 1,39 М РАСТВОРОМ СУЛЬФАТА

АММОНИЯ ПУТЕМ ДИАЛИЗА

Охлажденную сыворотку крови животных в целлофановом мешочке помещают в
1,39 М раствор сульфата аммония, перемешивают в холодильнике магнитной мешалкой 2 суток при трехкратной смене раствора соли. Осадок дважды промывают 1,39 М раствором аммония.

При этом из сыворотки крови овцы и крупного рогатого скота осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, однако иммуноглобулин G1, (- и (- глобулины присутствуют лишь в следовых количествах. Из сыворотки крови лошадей, главным образом выделяется иммуноглобулин G2, IgG(Т) присутствует лишь в небольшом количестве.

Таким образом, препарат получаемый 1,39 М раствором сульфата аммония путем диализа удобен для выделения IgG2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, однако наиболее чистый IgG2 получается из сыворотки крови лошадей.

ОСАЖДЕНИЕ СУЛЬФАТОМ НАТРИЯ

К охлажденной сыворотке крови по каплям добавляют холодный 2,53 М раствор сульфата натрия до конечной концентрации, равной 1 М. Перемешивают
2 час в холодильнике, осадок растворяют и диализируют. 1 М раствором сульфата натрия осаждаются иммуноглобулины G1 и G2, практически свободные от фракции (-глобулинов. По нашим данным, этот метод достаточно прост и выгоден для выделения иммуноглобулинов G1 и G2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота. Недостаток метода в том, что такая концентрация соли не обеспечивает полного осаждения иммуноглобулина G1. По составу, препарат, выделяемый сульфатом натрия, идентичен препарату, получаемому
1,39 М раствором сульфатом аммония, поэтому он наиболее пригоден для выполнения иммуноглобулина G2.

ВЫДЕЛЕНИЕ БЕЛКОВ НА ДЭАЭ - СЕФАДЕКСЕ А-50

Предварительно очищенные белки сыворотки выделяли на ДЭАЭ-сефадексе А-50 типа средний (100-200 меш). Предварительную обработку и регенерацию ДЭАЭ
-сефадекса А-50, а также выделение белков, 0,01 М калий- фосфатным буфером, рН 6,5 проводили по J.Baumstark et al (1964) с незначительными изменениями
(Сеитов З.С., Жумашев Ж.Ж.,1966).

Выделенный белок изучали электрофорезом в агаровом геле, где в зоне (
-глобулинов обнаруживались две нечетко разделенные ( -глобулиновые фракции
- IgG1 и IgG2, а иммуноэлектрофорезом, - три линии преципитации - IgG1,
IgG2 и IgM. Таким образом, применив метод J.Baumstark et al (1964) не получили чистые фракции IgG1 и IgG2 из сыворотки крови овец и крупного рогатого скота, а только их смесь.

Следует подчеркнуть, что указанные авторы разработали способ выделения чистого IgG из нормальной сыворотки крови человека, испольэуя ДЭАЭ
-сефадекс А-50 типа грубый и 0,01 М калий- фосфатный буфер рН, 6,5 . Однако
З.С. Сеитов и Ж.Ж.Жумашев (1966) этим методом не смогли выделить иммунохимически чистый иммуноглобулин G2 из сыворотки крови лошадей. Им удалось выделить смесь белков состоящую из IgG2 и IgМ и IgА. Аналогичные результаты получены при выделении IgG2 из из нормальной сыворотки овец
(Ж.Ж.Жумашев, З.С.Сеитов, 1968 а, б).

Результаты, отличные от результатов Baumstark et al (1964), по-видимому
, обусловлены особенностями белкового состава сыворотки крови этих видов животных. Таким образом, указанный метод - также способ предварительного выделения IgG2 из нормальной сыворотки крови.

ЗАКЛЮЧЕНИЕ

В заключение необходимо отметить, что американскому биохимику G.Edelman
(1972) и английскому биохимику К.РогIgг (1972), работающим в области изучения человеческих иммуноглобулинов была присуждена Нобелевская премия
1972 года. Присуждение Нобелевской премии указывает на большое внимание мировой научной общественности к иммуноглобулинам и на достижение определенных успехов з изучении иммуноглобулинов человека.

Что касается иммуноглобулинов сельскохозяйственных животных, то, к сожалению, многие вопросы выделения, идентификации и количественного определения этих защитных белков остаются еще слабо разработанными.

Главный защитный белок сельскохозяйственных животных IgG. Причем он существует в виде двух подклассов: G1 и G2, которые различаются аминокислотным составом, электрофоретической подвижностью, антигенным и биологическим свойствам. Однако выделение из сыворотки крови чистых препаратов IgG1 - очень сложная, и следовательно, не до конца решенная проблема.

Поэтому большинство литературных данных по этому вопросу касается IgG и лишь немногие IgG1 и IgG2.

IgM один из высокомолекулярных и сложноорганизованных белков сыворотки крови, состоящий из 5 субъединиц, соединенных лабильными дисульфиными связями. Этим и объясняется трудность его выделения и изучения. Хотя существуют несколько современных методических приемов, помогающих его выделению, ни один из них в отдельности не обеспечивает получения чистого
IgМ. Поэтому необходимо использовать комбинированные методы, основанные на особенностях его физико-химических свойств.

Так, до сих пор остается сложной задачей приготовление высокоочищенного
IgМ, пригодного для изучения его структурных особенностей и аминокислотного состава, антигенных свойств, а также получение к нему моноспецифических иммунных сывороток. По-видимому, этим и объясняется отсутствие работ по изучению пептидной структуры и аминокислотного состава IgМ у различных видов животных. Относительно мало работ, выполненных с помощью моноспецифических иммунных сывороток к IgM у животных, особенно у лошадей и овец.

Однако особый интерес, особую сложность для выделения представляет IgА, в частности у жвачных - крупного рогатого скота и овец. Это прежде всего связано с его небольшим содержанием в нормальной сыворотке крови. IgА относительно хорошо изучен только у человека благодаря появлению гибридом и моноклональных антител.

Изучение IgА у сельскохозяйственных животных начато недавно. Так, не изучены его структурные особенности и аминокислотный состав, слабо - электрофоретические, хроматографические и гель-фильтрационные свойства и молекулярные размеры.

Изучение иммунологического статуса животных методом радиальной иммунодиффуэии с использованием моноспецифических иммунных сывороток имеет практическое значение. Однако в настоящее время почти отсутствуют исследования по установлению уровня иммуноглобулинов у отечественных пород крупного рогатого скота, овец, лошадей и других сельскохозяйственных животных. Неизвестно также, как изменяется количественное соотношение иммуноглобулинов в зависимости от породы, пола, возраста, сезонов года и продуктивности животного. Пока мало исследованы иммуноглобулиновый спектр новорожденных и динамика содержания иммуноглобулинов в возрастном аспекте, особенно у лошадей и овец.

Изучение иммуноглобулинов человека показало, что во многих случаях нарушается биосинтез иммуноглобулинов, обусловливающий изменения нормального соотношения их в сыворотке. Такие исследования проведены только у человека и отсутствую у сельскохозяйственных животных. Пока не изучены и качественные и количественные изменения состава иммуноглобулинов при различных заболеваниях инфекционного и инвазионного характера.

Слабо изучена природа иммунного ответа у вакцинированных животных, особенно крупного рогатого скота и овец. Многочисленные исследования общего белка и его фракций у различных животных проведены главным образом методом электрофореза на бумаге, который имеет ограниченную аналитическую возможность. Это справедливо в отношении динамики белковых фракций сыворотки крови у молодняка сельскохозяйственных животных в возрастном аспекте, а также иммуноглобулинового, белкового и казеинового состава молозива и молока овец и лошадей.