Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4  5  6  7 | Следующая страница реферата

При серологической идентификации 82 эпизоотических НАД--зависимых культур бактерий, выделенных при фиброзно-геморрагических пневмониях свиней и классифицированных как A.pleuropneumoniae отнесены к серовару 2 -12,9%, 3
-14,53%, 4 -8,53%, 6 -3,65%, бактериям «малой группы» -7,31%. Большую группу штаммов серологически идентифицировать не удалось. Культуры последней группы имели антигенное родство с сероварами 3,6,8,10, но при исследовании в перекрёстной РА с адсорбцией были не идентичны им.

2.1.7. Результаты изучения широты распространения сероваров
A.pleuropneumoniae на основании серологических исследований.

Была предпринята попытка дать оценку циркуляции различных сероваров
A.pleuropneumoniae в свиноводческих хозяйствах одной из областей центральной России по результатам серологических исследований. В РНГА исследовали 639 сывороток крови свиней из десяти хозяйств. Установлено преобладание антител к сероварам 1,4,6,3,2,12. При бактериологическом исследовании в данном регионе культур сероваров 1 и 12 не выделяли. Причины такой ситуации требуют дальнейшего изучения. В сыворотках крови некоторых серопозитивных свиней удалось выявить нейтрализующие антитела к гемолизинам
A.pleuropneumoniae, что свидетельствует о наличии определённого иммунитета к A.pleuropneumoniae.

2.1.8. Разработка и апробация ускоренных серологических методов обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae в патологическом материале.

Для обнаружения антигенов A.pleuropneumoniae непосредственно в тканевом материале были испытаны реакции коагглютинации (РКА) и двухступенчатой иммунофлуоресценции (РИФ).

Опыты показали, что РКА может быть использована для видовой и серотиповой идентификации A.pleuropneumoniae. Серотиповую специфичность результатов РКА удаётся повысить путём уменьшения дозы сыворотки для сенсибилизации носителя и использования в реакции растворимых капсульных антигенов. Более активные видовые диагностикумы удалось сконструировать при использовании поливалентных сывороток, полученных от кроликов, иммунизированных не моноантигенами, а смесью антигенов A.pleuropneumoniae различных сероваров. Использование РКА как метода видовой идентификации потребовало выяснения межвидовых антигенных связей A.pleuropneumoniae.
Изучали антигенное родство данного вида бактерий с A.suis, A.lignieresii,
P.multocida (А,В,Д), H.parasuis (A,B,C,Д), B.bronchiseptica, S.cholerasuis,
S.tiphimurium. Наиболее выраженное антигенное родство установлено с A.suis и A.lignieresii, наличие которых в исследуемом материале может обусловить ложноположительные результаты РКА.

Серовариантную дифференциацию типовых культур A.pleuropneumoniae проводили в РИФ с предельными разведениями антисывороток первой ступени, обеспечивающими свечение клеток свиноводства гомологичными реагентами на четыре креста. Обнаружили перекрёстные реакции сероваров 1 и 2, 2,3 и 6,
3,2,6 и 8, 4 и 7, 10 и 12. Таким образом, надёжной серовариантной дифференциации в ряде случаев добиться не удалось. Слабые перекрёстные реакции интенсивностью на два креста получены с культурами A.suis,
A.lignieresii. Не отмечено перекрёстных реакций с P.multocida (А,В,Д),
H.parasuis (А,В,С,Д), E.coll, S.cholerasuis и S.tiphimurium.

При изучении специфичности РКА как метода обнаружения антигенов возбудителя в органах и тканях исследовали супернатанты тканевых (лёгочных) гомогенатов клинически здоровых свиней, морских свинок и получили неспецифические замедленные положительные реакции. Для устранения неспецифической аглютинации стафилококковые антительные диагностикумы дополнительно обрабатывали нормальной кроличьей сывороткой, увеличивали концентрацию альбумина в диагностикуме, прогревали исследуемый материал при
100(С (10,60 мин.) 120(С (15 мин.). Эффективной оказалась термическая обработка материала. Необходимость прогревания исследуемого материала заставила рассмотреть влияние этого фактора на антигены возбудителя.
Известно, что клетки A.pleuropneumoniae содержат специфические термостабильные и – лабильные антигены (K.Mittal et al., 1987). Изучение этого вопроса показало, что по термостабильности антигенов культуры можно подразделить на группу термоустойчивых (сер.2,3,6,8,10) и термолабильных
(сер.1,7, штамм 202). У культур последней группы при кипячении (60 мин.) снижалась активность антигенов в серологических реакциях, особенно антигенов серовара 1 (шт.ССМ5869). Прогревание антигенов A.pleuropneumoniae при 100(С в течении 10 минут на серологической активности антигенов возбудителя, кроме серовара 1 не сказывается.

Возможность выявления антигенов возбудителя в тканевом материале
(лёгкие), при помощи РКА и РИФ первоначально изучали на морских свинках, белых мышах и свиньях, заражённых культурами A.pleuropneumoniae, а также
A.suis и гемофильными бактериями «малой группы».

Результаты исследований показали совпадение данных бактериологии РИФ и РКА. Слабые положительные реакции были получены с тканевым материалом, содержащим A.suis.

При исследовании лёгочной ткани от 78 свиней с явлениями пневмонии из
29 материалов были выделены микоплазмы, из 15 -стафилококки или стрептококки, изменений 16 - P.multocida, из 2 - P.multocida и гемофильные бактерии «малой группы», из 7 - гемофильные бактерии «малой группы», из 9 -
S.cholerasuis. При наличии в патологическом материале P.multocida в двух случаях были получены позитивные результаты РКА с диагностикумом против штамма №202 («малая группа»), не подтверждённые данными бактериологии. В остальных случаях при исследовании материалов, содержащих указанные выше гетерологичные виды бактерий результаты РКА и РИФ были отрицательными. В девяти случаях изоляции культур «малой группы» данные бактериологических исследований, РКА и РИФ совпали.

Полученные данные позволяют оценить РКА и РИФ как достаточно специфические и чувствительные методы обнаружения антигенов
A.pleuropneumoniae. Преимуществом РКА является возможность исследования длительно хранившегося материала и выявления растворимых антигенов.

2.2. Разработка и испытание экспериментальных образцов инактивированной вакцины против актинобациллёзной плевропневмонии свиней.

Возрастная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией диктует необходимость вакцинации просят-отъёмышей и проблема реактогенности препарата актуальна. Исследование остаточной токсичности инактивированных цельноклеточных суспензий A.pleuropneumoniae в тесте прироста массы мышей показало высокие её уровни. Из испытанных способов инактивации наиболее эффективным оказалась обработка формальдегидом (0,2%) с последующей выдержкой бактериальных взвесей при 4-6(С в течении 30-45 суток. Различия сравниваемых показателей по этому препарату, а также инактивированных 0,1% формальдегида и тиомерсалом были достоверны, на уровне значимости от Р(0,01
– до Р(0,05 (в зависимости от сроков хранения). Полученные данные были учтены в технологии изготовления инактивированной эмульгированной вакцины.
Испытание вакцины такого типа на 21,38 – 40 - дневных поросятах и супоросных свиноматках показало её безвредность.

В качестве лабораторных моделей для испытания специфической активности инактивированной вакцины были испытаны морские свинки живой массой 200—250г и белые мыши живой массой 14-16г. Мышей вакцинировали подкожно, двукратно с интервалом 10 суток в дозе [pic] с последующим определением ЛД50 заражающей культуры на вакцинированных и контрольных животных («внутрибрюшинная модель»). ЛД50 культуры, установленная на вакцинированных животных пятикратно, превышала тот же показатель, полученный на контрольных животных.

Морских свинок акционировали однократно различными дозами вакцины с последующим интраназальном заражении гомологичной культурой в дозе [pic]
(«лёгочная модель»). Подобный методический подход позволил определить ИМД50 вакцины. По нашему мнению, «лёгочная модель» предпочтительнее, поскольку этот метод соответствует естественным входным воротам возбудителя инфекции.
С другой стороны, об эффективности иммунизации можно дополнительно судить по наличию поражений в лёгких их массивности. Определённую информацию дают показатели серологического ответа - между объёмом поражённой лёгочной ткани и среднегрупповыми титрами антител (РСК) установлена функциональная обратная зависимость [pic]

Исследовали влияние типа адъюванта на иммунологическую эффективность инактивированной вакцины. В качестве адъювантов использовали гидрат окиси алюминия и масляный адъювант на основе лёгкого минерального масла.
Эмульгированной вакциной привили 315 поросят (полсектора) в неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии хозяйстве, 317 свиней этого же сектора служили контролем. Гидроокись -алюминиевую вакцину ввели 647 поросятам, контролем служили 652 животных. Наблюдение за животными вели в течении 86 дней, заболевание свиней актинобациллёзной плевропневмонией наблюдали во всех группах. Индекс и коэффициент эффективности эмульгированной вакцины в этом опыте составил соответственно 7,95 и 8,42%. Аналогичные показатели в группе свиней привитых РОА вакциной были соответственно 3,12 и 67,98%, что свидетельствует о большей эффективности эмульгированной вакцины.
При конструировании инактивированной вакцины, исходя из полученных данных о накоплении в культуральной жидкости экзотоксина, гемолизина и капсульной субстанции, исследовали влияние растворимых антигенов бульонных культур на её иммуногенность. В опыте на белых была определена ИМД50 эмульгированной вакцины приготовленной на основе бульонных культур и отмытых клетках возбудителя. ИМД50 вакцины первого типа составила [pic] микробных клеток, у вакцины второго типа ИМД50 не удалось рассчитать, так как процент защиты при избранных дозах вакцины не превысил 36,36%. Следовательно, включение растворимых компонентов реакторных культур возбудителя в состав инактивированных вакцин необходимо.

При отработке оптимальной схемы иммунизации свиней инактивированной эмульгированной вакциной исследовали влияние кратности её введения на уровень иммунитета у свиней. В одном случае свиньям (8 голов) вводили [pic] вакцины однократно, в другом случае – дробно 1 и2 [pic] интервалом 10 суток
(8 голов). Свиней заразили через 20 дней после вакцинации интраназально в дозе [pic] Установлено, что среди свиней, вакцинированных двукратно, летальных исходов не было. Из числа привитых однократно погибло 50% животных. Между животными этих групп также выявлена достоверная разница по высоте титров антител (РА). Исходя изменений полученных данных можно заключить, что результаты серологических реакций могут служить косвенным групповым показателем формирования иммунитета.

Исследовали влияние суммарной дозы антигена при двукратной (интервал
- 15 суток) вакцинации свиней эмульгированной вакциной на состояние иммунитета. Установлено, что среди привитых различными дозами вакцины свиней (16 голов) при контрольном интраназальном заражении [pic] летальных исходов не было, в контроле погибло 50% животных. Среди животных, привитых вакциной в суммарных дозах 10,6,4 и 2 [pic], объём поражённой лёгочной ткани в среднем по группам соответственно составил 5,25(6,70, 5,94(8,01,
5,69(10,24, 10,50(8,57%. У контрольных свиней было поражено 25,1% лёгочной ткани. Различия в титрах комплементсвязывающих антител у вакцинированных животных перечисленных групп перед заражением были статистически не достоверны, также не достоверны различия по объёму поражённой лёгочной ткани. Свиноводства учётом заболеваемости, количества летальных исходов и объёма поражённой лёгочной ткани мы считаем оптимальной дозу вакцины 4
[pic] [pic], введённую по схеме 1+3 [pic].

Исследовали сроки формирования и длительность иммунитета у свиней, привитых однократных эмульгированной вакциной в дозе 5[pic] с контрольным интраназальным заражением через 10, 30 и 60 дней после иммунизации. Исходя из уровня защиты вакцинированных животных указанных групп и площади поражённой лёгочной ткани, близкие показатели состояния иммунитета имели свиньи через 10 и 30 дней со снижением к 60 дню после вакцинации. Между показателями защиты (%) и площади поражения лёгочной ткани выявлена обратная функциональная зависимость (r= -1). Значительная заболеваемость свиней актинобациллёзной плевропневмонией в первый период откорма в неблагополучном хозяйстве, с учётом полученных данных, свидетельствует о необходимости ревакцинации свиней в период передачи на откорм.

Определение иммуногенности вакцины в опытах на белых мышах в процессе хранения при 4-6(С показало, что в интервале 1-11 месяцев ИМД50 препарата колебалась в пределах [pic] микробных клеток, что позволяет говорить о малом изменении активности препарата в указанные сроки.

С учётом результатов испытания различных типов инактивированных вакцин на лабораторных животных и свиньях была проведена апробация экспериментальных образцов вакцин против актинобациллёзной плевропневмонии свиней в производственных условиях.

Первоначально эмульгированная вакцина была испытана на безвредность и иммунологическую эффективность на ограниченном контингенте свиней различного возраста в хозяйстве, неблагополучном по актинобациллёзной плевропневмонии свиней. В последующем в этом же хозяйстве проводилась поголовная вакцинация животных по следующей схеме: внутримышечно свиноматкам за 20-25 дней до ожидаемого опороса в дозе 1 [pic], аналогичную дозу вводили ремонтным свинкам, поросят вакцинировали в дозе 1[pic] в возрасте 35 - 40 дне й. В период проведённых исследований вакцинации было подвергнуто 1677,4 тысячи свиней.

Исследования показали, что до начала вакцинации падёж свиней с диагнозом актинобациллёзной плевропневмонии составил 30,22% от общего количества павших животных, при частичной вакцинации поголовья -12,28%, при полной вакцинации - 8,89%. Между уровнем вакцинации и падёжом свиней от актинобациллёзной плевропневмонии установлена достаточно сильная обратная связь ( r= -0,71). Применение вакцины обеспечило снижение отхода свиней по причине актинобациллёзной плевропневмонии, в зависимости от анализируемого периода в 3 - 5 раз и увеличение живой массы поросят на 7,42 - 8,29 кг при передаче на откорм. Частота терапевтического вмешательства ветеринарного персонала в группах вакцинированных поросят была в 2,11 раза реже, чем среди не вакцинированных животных.

Выводы
Исследование таксономического положения эпизоотических штаммов НАД-- зависимых бактерий, выделенных при пневмониях и генерализованных серозитах свиней методом нумерического анализа, позволило дифференцировать их по фенотипическим свойствам на кластеры, соответствующие видам Actinobacillus
(Haemophilus) pleuropneumoniae, Haemophilus parasuis и таксону гемофильных бактерий «малая группа». Культуры кластера Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae имеют большее фенотипическое сходство с видами рода
Actinobacillus (91,23) и меньшее с представителями рода Haemophilus
(81,99%). На уровне подобия 95% бактерий кластера «малая группа» выделяются в самостоятельный таксон.
Генетический анализ таксономического положения референтных и эпизоотических
НАД--зависимых штаммов Actinobacillus (Haemophilus) pleuropneumoniae и культур P.haemolytica - подобных бактерий (2-ой биовар A.pleuropneumoniae) показал, что они образуют генетическую общность с уровнем гомологии ДНК 70-
98%. ДНК культур 2-го биовара и эпизоотических штаммов A.pleuropneumoniae имеют гомологию с ДНК A.suis – 33 - 38%, с ДНК H.parasuis и P.multocida – не более 9%, что свидетельствует о принадлежности эпизоотических и референтных штаммов к роду Actinobacillus, но не Haemophilus и Pasteurella.
Референтный штамм J 95 гемофильных бактерий таксона «С» по результатам гибридизации ДНК к роду Haemophilus не относится.
Результаты изучения таксономического положения НАД--зависимых бактерий, выделенных при пневмониях и серозитах свиней, позволили определить в качестве основных дифференцирующих фенотипических признаков:
НАД—зависимость, образование щелочной фосфатозы, уреазы, гемолизина, кислоты из ксилозы, маннита, маннозы. Для дифференциации культур
НАД—независимого биовара A.pleuropneumoniae от сходных бактерий минимальный набор определяемых признаков включает продукцию индола, уреазы, утилизацию цитратов, наличие жгутиков. Для установления ферментативных свойств НАД-- зависимых бактерий можно использовать дифференциально - диагностические среды в микрообъёмах и диагностический набор ПБДЭ Горьковского НИЭМ, что исключает использование чистого НАД или других его источников как факторов роста.
К A.pleuropneumoniae и H.parasuis чувствительны при внутрибрюшинном и интраназальном заражении морские свинки (живая масса 200-250г) и белые мыши
(живая масса 14-16г), которые могут быть использованы для определения патогенных свойств культур, изучения вопросов пато - и иммуногенеза при этих инфекциях.
Входными воротами возбудителя инфекции при гемофилёзном полисерозите являются органы дыхания. При экспериментальном (трахеальном) заражении свиней H.parasuis инкубационный период составляет 6-8 часов. У заражённых свиней развивается катаральная пневмония и, в результате диссеминации возбудителя, генерализованные серозиты с одновременным поражением серозных оболочек грудной, брюшной полостей, пери – и эпикарда.
В естественных условиях H.parasuis вызывает у поросят-отъёмышей пневмонию, у части животных развивается септическая стадия с поражением серозных оболочек, суставов, головного мозга. У отдельных поросят встречается классическая форма болезни Глессера - генерализованные серозиты без микроскопически выраженной пневмонии. У экспериментально заражённых и естественно больных свиней наиболее часто удаётся изолировать H.parasuis из поражённых серозных оболочек.
Входными воротами возбудителя инфекции при актинобациллёзной плевропневмонии свиней являются органы дыхания. Инкубационный период при экспериментальном интраназальном заражении составляет 2-4 часа, контактном
– до 3 суток, в естественных условиях – 2-8 суток. Диссеминация возбудителя в организме заражённых животных происходит на фоне имеющихся изменений в лёгких. Наиболее постоянно культуры возбудителя удаётся изолировать от экспериментально заражённых и естественно больных животных из поражённой ткани лёгких и регионарных лимфатических узлов.
Культуры A.pleuropneumoniae на начальной стадии логарифмического роста синтезируют термолабильные гемолизин и экзотоксин, которые определяют повышенную вирулентность молодых (6-8- часовых) культур возбудителя и играют существенную роль в развитии патологических изменений в лёгких заражённых животных.
Макроскопически сходные изменения в лёгких свиней могут вызвать
A.pleuropneumoniae, гемофильные бактерии «малой группы» и A.suis , поэтому решающее значение в диагностике актинобациллёзной плевропневмонии имеют результаты бактериологического исследования.
При серологической идентификации эпизоотических культур H.parasuis установлено наличие сероваров А,В,С,Д, Бакоса, а также выявлены четыре серологические группы штаммов, не укладывающиеся в известную схему Бакоса, которая не охватывает всего антигенного многообразия вида.
Серологическая идентификация эпизоотических культур A.pleuropneumoniae, выделенных от свиней в хозяйствах Российской Федерации, выявила наличие сероваров 2,3,4,6 и группы нетипируемых штаммов. Исследования в РНГА сывороток крови свиней из различных хозяйств показало доминирование антител к сероварам 1,2,4,6,12.
На основании проведённых исследований разработана и используется в практике схема лабораторной диагностики актинобациллёзная ( гемофилёзная ) плевропневмонии и гемофилёзного полисерозита свиней, включающая: правила взятия материала для бактериологического исследования, методы выделения и идентификации культур возбудителя по биологическим свойствам. Также разработаны и рекомендованы методы видовой и серовариантной идентификации культур A.pleuropneumoniae и обнаружения антигенов этого вида бактерий в патологическом материале при помощи реакции коагглютинации.
Разработана и предложена технология изготовления, контроля использования вакцины против гемофилёзной (актинобациллёзная) плевропневмонии свиней, что нашло отражение в соответствующих нормативных документах: «Инструкция по изготовлению и контролю вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней», «Вакцина против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированная. Технические условия ТУ 10-09-53-90». «Наставление по применению вакцины против гемофилёзной плевропневмонии свиней эмульгированной», утверждённых ГУВ ГК Совмина СССР по продовольствию и закупкам 11.07.1990г.
Инактивированные вакцины из клеток A.pleuropneumoniae обладают значительной остаточной токсичностью. Эффективное снижение токсичности готовых препаратов достигается инактивацией бактериальных суспензий 0,2% формальдегида с последующим выдерживанием до употребления при 4-6(С в течение 45 суток.
В качестве лабораторных моделей при оценке иммуногенности инактивированных актинобациллёзных вакцин могут быть использованы белые мыши – подкожная двукратная иммунизация с последующим внутрибрюшинном заражением различными дозами вирулентной культуры, или морские свинки в варианте подкожной вакцинации с последующим интраназальном заражением.
Максимальной иммуногенностью для свиней обладают инактивированные эмульгированные вакцины из клеток A.pleuropneumoniae с включением в их состав растворимых антигенов, накапливающихся в реакторных культурах в процессе роста.
В опытах прямого заражения при испытании эффективности иммунизации в условиях неблагополучного хозяйства установлено, что разработанная инактивированная вакцина не защищает полностью иммунизированных свиней от заражения, но обеспечивает более лёгкое течение болезни, в частности снижается отход в 3-5 раз, частота терапевтического вмешательства снижается в 2,11 раза, увеличивается живая масса поросят при передаче на откорм на
7,42 – 8,29кг, что позволяет рассматривать вакцинацию как экономически целесообразный составной компонент комплекса лечебно-профилактических мероприятий по борьбе с актинобациллёзной плевропневмонией свиней.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: профессиональные рефераты, дипломная работа проект.





Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4  5  6  7 | Следующая страница реферата