Кафедра клинической фармакологии и антимикробной химиотерапии Смоленской государственной медицинской академии

Контактный адрес: Дехнич Андрей Владимирович
214019, Смоленск, а/я 5, Факс: (0812)61-12-94 andrei@microbiology.ru

УДК 615.33.015.8.07

Выявление резистентности к метициллину и другим b-лактамным антибиотикам методом скрининга

С момента появления в 70-х годах метициллинорезистентные стафилококки и прежде всего метициллинорезистентные штаммы Staphylococcus aureus (MRSA) являются одними из ведущих возбудителей нозокомиальных инфекций. Частота
MRSA в структуре стафилококковых инфекций в последние годы резко возросла во всем мире, например, в США с 2% в 1975 г. до 35% в 1996 г.
Резистентность стафилококков к оксациллину (метициллину) может быть обусловлена тремя основными механизмами: o продукцией дополнительного пенициллинсвязывающего белка (ПСБ) – ПСБ-2а

(фермента, участвующего в синтезе клеточной стенки), кодируемого хромосомальным геном mecА – классическая, или истинная резистентность к метициллину (оксациллину); o инактивацию вследствие гиперпродукции бета лактамаз; o модификацию нормальных ПСБ.

С клинической точки зрения, важно дифференцировать штаммы с классической
(mecА-обусловленной) резистентностью от штаммов с двумя другими редковстречающимися механизмами резистентности, обусловливающими низкий или пограничный уровень устойчивости. Это связано с тем, что при инфекциях, вызванных штаммами с mecA-обусловленной резистентностью, терапия бета- лактамными антибиотиками (пенициллинами, цефалоспоринами, карбапенемами) будет неэффективна.
Кроме того, эти штаммы часто бывают резистентны практически ко всем другим классам антибиотиков за исключением гликопептидов (ванкомицин, тейкопланин). Фенотипические характеристики, которые могут помочь дифференцировать три перечисленных механизма резистентности, изложены в таблице.

ТИПЫ РЕЗИСТЕНТНОСТИ К МЕТИЦИЛЛИНУ(ОКСАЦИЛЛИНУ) У СТАФИЛОКОККОВ

Штаммы с классическим типом резистентности могут в свою очередь быть гомо- или гетерогенными по типу экспрессии устойчивости. При гомогенном типе экспрессии практически все микробные клетки проявляют резистентность в стандартных in vitro тестах, в то время как при гетерогенном типе только небольшая часть клеток проявляет резистентность фенотипически. Нередко только 1 из 10–100 млн клеток в популяции с наличием гена mecА экспрессирует резистентность, что обусловливает получение пограничных результатов при определении чувствительности к оксациллину (МПК – 2–8 мг/л). Резистентность, обусловленная гиперпродукцией b-лактамаз и мутацией нормальных ПСБ, также приводит к получению пограничных значений МПК. Однако резистентность к оксациллину, обусловленная гиперпродукцией b-лактамаз, легко отличается от классической резистентности по ее обратимости при использовании ингибиторов b-лактамаз.
В отличие от штаммов с классической резистентностью гиперпродуценты b- лактамаз и штаммы с мутациями нормальных ПСБ обычно не имеют множественной резистентности к другим антибиотикам.
Наличие классической резистентности наиболее легко определить методом скрининга, так как рост микробных клеток с неклассическими типами резистентности обычно ингибируются.
Для определения чувствительности используется оксациллин ввиду его более высокой стабильности при хранении по сравнению с метициллином.

ПРИНЦИП
Для идентификации резистентности к оксациллину (метициллину) у стафилококков необходимо соблюдение следующих условий: o добавление 4% NaCl в агар с оксациллином (pH 7,2–7,4, так как при более низком pH увеличивается число ложноотрицательных результатов); o температура инкубации 35oС; o длительность инкубации 24 ч для S.aureus и 48 ч – для коагулазоотрицательных стафилококков; o стандартизированное число микроорганизмов.

МИКРООРГАНИЗМ
Чистая культура Staphylococcus spp., инкубированная в течение 18–24 ч на кровяном агаре.

МАТЕРИАЛЫ

1. Агар Мюллера–Хинтон с добавлением 4% NaCl (4 г на 100 мл среды) и 6 мг/л оксациллина (0,6 мг на 100 мл среды). Агар Мюллера–Хинтон хранится при температуре 2–8oС, готовится согласно прописи на этикетке, 4% NaCl добавляется до автоклавирования.

2. Субстанция оксациллина с известной активностью предварительно растворяется в стерильной дистиллированной воде (расчет концентрации оксациллина проводят с учетом его активности) и добавляется в охлажденный на водяной бане до 48 –50oС агар Мюллера –Хинтон.

Приготовленный агар разливается по чашкам с толщиной слоя 3–4 мм (на чашку диаметром 100 мм – 25 мл). Готовые чашки со средой хранятся в пластиковых пакетах при температуре 4 –8oС не более 5 сут.

3. Для контроля роста необходимо также приготовить чашки с агаром, содержащим 4% NaCl, но без антибиотика.

4. Кровяной агар с чистой культурой стафилококка, инкубированной в течение 18 –24 ч.

5. Стерильный физиологический раствор.

6. Стандарт мутности 0,5 по Мак-Фарланду.

7. Стерильные тампоны или микропипетка (10 мкл).

8. Термостат с температурой инкубирования 35oС.

КОНТРОЛЬ КАЧЕСТВА

Исследование проводят при обязательном контроле роста испытуемых культур на агаре Мюллера–Хинтон с 4% NaCl без оксациллина (культуру наносят так же, как на агар с оксациллином).
Контрольные штаммы:
S.aureus ATCC 38591 – резистентный;
S.aureus ATCC 29213 – чувствительный.

ПОСТАНОВКА ТЕСТА

Приготовление инокулюма. Бактериальную взвесь стафилококка готовят из нескольких колоний с одинаковой морфологией на стерильном физиологическом растворе (3 мл) и доводят до мутности 0,5 по Мак-Фарланду (1,5·108 КОЕ/мл).