Предыдущая страница реферата | 1  2



Статистическая обработка цифровых данных осуществляли методом вариационной статистики с использованием параметрического критерия (t) Стьюдента. В случае малых выборок использовали непараметрические статистические критерии. Расчеты производили с использованием программы STATGRAF (Statistical Graphics System), версия 2.1.

2. Результаты собственных исследований Гуморальный и клеточный иммунитет на разных стадиях болезни

Исследование изменений в иммунной системе при развитии ВИЧ-инфекции имело целью выявить показатели, достоверно изменяющиеся при переходе от одной клинической стадии (фазы) к другой.

Анализ изменений иммунологических параметров больных позволяет заключить, что в динамике ВИЧ-инфекции, в первую очередь, происходит прогрессирующее снижение функциональной состоятельности иммунной системы по мере развития клинической картины заболевания. Выявленная дефектность иммунного статуса касается, прежде всего. Т-системы иммунитета. Однако далеко не все исследованные традиционные иммунодиагностические параметры в своей динамике достоверно отражают начало перехода от бессимптомной фазы заболевания к манифестным стадиям. Достоверное различие между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдалось у следующих показателей:

- при переходе от бессимптомной фазы (IIБ) к ПГЛ (IIB) - увеличение относительного содержания лимфоцитов от 39,00±2,13 до 45,92±1.96% (р<0,05), уменьшение содержания СD8+-лимфоцитов (супрессоров) ОТ 36,90±2.90 до 27,83±1,80% (p<0,01);

- при переходе от ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) - увеличение содержания В (IgA+) -лимфоцитов от 0,06±0,01 до 0,10±0,01xlO9/л (p<0,01), увеличение концентрации IgG от 11,74±0.89 до 13.77±0.66 г/л (р<0.05), увеличение содержания циркулирующих иммунных комплексов - уменьшение пропускания светового потока от 92,1±1,2 до 84.3±1.6% (р<0,01).

Как показал анализ, процентные (относительные) показатели во многих случаях нельзя использовать без оценки абсолютных значений. абсолютное содержание В(IgA+)-лимфоцитов, остается неизменным на стадии IIIA по сравнению с бессимптомной фазой, изменение концентрации иммуноглобулинов IgG происходят в диапазоне нормальных значений (9-15 г/л), что снижает прогностическую информативность указанных показателей. Важен и тот факт, что нет единого иммунологического показателя, который бы достоверно характеризовал оба перехода ВИЧ-инфекции - от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от генерализованной лимфаденопатии к стадии вторичных заболеваний.

Содержание продуктов, связывающих тиобарбитуровую кислоту, в мононуклеарах периферической крови

Уже в бессимптомной фазе у ВИЧ-инфицированных отмечается увеличение средних значений содержания ТБК-связывающих соединений в мононуклеарах периферической крови на 56%, а в их ядрах - на 90%. По мере развития заболевания уровень названных продуктов свободно-радикального окисления возрастает, достигая максимума у больных в стадии IIIB. При этом средние значения в группе больных в стадии IIIB превышали контрольные в 3.2 раза в мононуклеарах и в 4,6 раза в ядрах мононуклеаров. Однако достоверный рост показателей свободнорадикального окисления между группами больных ВИЧ-инфекцией отмечается в мононуклеарах. но не в ядрах, и только в одном из интересующих нас переходах клинического течения - из бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) от 2,82±0,30 до 3,61±0.37 нмоль/106 клеток (р<0,01).

Активность форм ксантиноксидазы в мононуклеарах периферической крови

Отмечается прогрессивное возрастание общей ксантиноксидазной активности в мононуклеарах периферической крови пациентов по мере развития заболевания. Однако динамика состояния D- и 0-форм фермента, оказалась разнонаправленной: по мере прогрессирования заболевания происходит постепенное снижение средних значений активности D-формы ксантиноксидазы (на 12,5% в стадии IIB и на 75,5% в стадии III В) и нарастание активности 0-формы фермента (на 13,4% в стадии ПБ и в 6,5 раз в стадии IIIB). При этом достоверного уменьшения активности D-формы ксантиноксидазы в переходах клинического течения IIБ-IIB и IIB-IIIA не отмечается, а активность 0-формы достоверно возрастает только при переходе от бессимптомной фазы (ПБ) к ПГЛ (IIB) (р<0,05).

Интегральные метаболические показатели дестабилизации генома мононуклеаров периферической крови

У ВИЧ-инфицированных уже в бессимптомной фазе отмечается увеличение средних значений содержания полидезоксинуклеопротеидов (ПДН) в 1,3 раза, а выраженности однонитевых разрывов ДНК в 2.3 раза. Выявленные изменения прогрессируют по мере развития ВИЧ-инфекции, однако достоверных различий показателей нестабильности ге-нома между группами больных не отмечается, что не позволяет рассматривать их в качестве прогностических критериев перехода клинического течения болезни из одной стадии в другую.

Характеристика поликлональных антител к белкам семейства БТШ-70

Каждый из полученных нами препаратов антител распознавал специфический профиль изоформ семейства БТШ-70, денатурированных до-децилсульфатом натрия. Антитела из сыворотки кролика N5 (антитела N5) различают две зоны молекулярной массы 68-72 кДа, которые представляют собой две изоформы семейства БТШ-70. Тепловое воздействие (43°С - 30 минут) на клетки HeLa, белковый экстракт которых использовали для приготовления иммуноблота. отражалась на результате иммуноблота усилением интенсивности зоны, соответствующей hsp70. Антитела N7 распознавали и hsp70. и р75, тогда как антитела N10 главным образом связывались только с р75. a Nil - с hsp70. Такие же примеры распознавания белков семейства БТШ-70 на иммуноблотах наблюдались, когда вместо клеток HeLa для анализа использовали мононуклеары периферической крови человека.

Для того, чтобы определить компоненты семейства БТШ-70, которые реагируют в неденатурированном состоянии с представленной панелью антител, выполнено исследование иммунопреципитации. И одно-, и двумерные электрофоретические анализы иммунных комплексов не показывали различий между антигенами, преципитированными с тестируемыми антителами: иммунные комплексы содержали только одну зону. соответствующую индуцибельной форме hsp70. Иммобилизованные на твердой фазе антитела N5 и N7 также избирательно реагировали с антигеном hsp70 из белкового экстракта клеток HeLa.

В итоге, по причине особых свойств полученных антител к БТШ-70. которые, как оказало-сь, распознают только один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах БТШ-70. а также по причине свойств белков семейства БТШ-70 легко образовывать прочные соединения е другими белками клетки в обычных условиях, не представилось возможным использовать полученные поликлональные антитела

для создания иммуноферментной тест-системы, предназначенной для количественного определения БТШ-70 в белковых экстрактах мононуклеаров периферической крови. Поэтому пришлось использовать указанные антитела в конструкции другого метода для определения БТШ-70 в белковых экстрактах - метода иммуноблотинга с -последующей денситометрией проявленных зон белков.

Изменения состояния семейства БТШ-70 мононуклеаров периферической крови на различных стадиях ВИЧ-инфекции

Семейство БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови всех групп обследованных представлено полностью тремя изоформами: индуцибельной (hsp-70), конститутивной (hsc-70) и белком р75. Не обнаружено достоверных различий в соотношении изоформ БТШ-70 между донорами и пациентами в бессимптомной фазе ВИЧ-инфекции. Напротив, у больных в более поздних стадиях заболевания выявлено достоверное изменение анализируемых параметров по сравнению с контрольной группой. Наблюдается прогрессивное уменьшение средних значений содержания изоформ hsp-70 и р75, увеличение hsc-70 по мере развития клинической картины заболевания. Однако достоверное различие изоформ семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови между группами больных ВИЧ-инфекцией наблюдали только по отношению к конститутивной изоформе (hsc-70). содержание которой увеличивается при переходе заболевания из бессимптомной фазы (ПБ) к фазе ПГЛ (IIB) от 59,3±2,5 до 66.2±2,7 у.д.е. (р<0,05) и от фазы ПГЛ (IIB) к стадии вторичных заболеваний (IIIA) от 66,2±2.7 до 7l,l±3,0 у.д.е. (р<0,05).

Исследование влияния теплового воздействия на мононуклеары периферической крови обследованных лиц позволило выявить прогрессивное достоверное уменьшение содержания индуцибельной изоформы hsp-70 при переходах ПБ к IIB от 38,9±4,3 до 30.4±3.1 у.д.е.' и IIB к IIIA от 30,4±3,1 до 22.1±3.7 у.д.е. (р<0,05).

Нами предложен индекс hsp-70 Tlll/hsp-70 N. представляющий собой отношение содержания индуцибельной изоформы семейства БТШ-70 в клетке, подвергнутой тепловому шоку in vitro, к содержанию этого белка в клетке, находящейся при t=370С. Индекс hsp-70 TШ/hsp-70 N характеризует реакцию клетки на экстремальное воздействие синтезом и накоплением индуцибельной изоформы. по которому косвенно можно судить об адаптивной состоятельности исследованных клеток. Достоверное уменьшение индекса hsp-70 TlB/hsp-70 N наблюдается в обоих переходах клинических стадий: ПБ - IIB от 4,23 до 3.42 (р<0,05) и IIB - IIIA от 3,42 до 2.99 (р<0.05). что свидетельствует о прогрессивном ослаблении адаптивной функции мононуклеаров периферической крови. Воздействие ультрафиолетового облучения на нононуклеары периферической крови вызывало аналогичные сдвиги в системе белков теплового шока во всех группах больных.

Представленный анализ полученных результатов выявляет значимость динамики показателей семейства белков теплового шока БТШ-70 мононуклеаров периферической крови для прогноза перехода клинического развития ВИЧ-инфекции от бессимптомной фазы к генерализованной лимфаденопатии и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

Патогенетическая связь исследованных биохимических показателей и белков теплового шока БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови при ВИЧ-инфекции

Выявленная динамика показателей нестабильности генома мононуклеаров периферической крови у больных ВИЧ-инфекцией сопровождалась существенным увеличением концентрации соединений, связывающих тиобарбитуровую кислоту, (продуктов свободнорадикального окисления) в клетках и их ядрах, что свидетельствует о повреждении ДНК мононуклеаров свободными радикалами. Ведущим генератором активных форм кислорода при этом. судя по полученным результатам, служит 0-форма ксантиноксидазы, образующаяся из D-формы фермента в результате ее ограниченного протеолиза. В свою очередь, протеолитическая трансформация D-формы ксантиноксидазы в 0-форму может быть прооксидантно-индуцированной.

Таким образом можно предположить, что повреждение ДНК мононуклеаров вызвано свободными радикалами, генерируемыми ксантинок-сидазой. В результате атаки ДНК свободными радикалами наблюдается образование.апуриновых/апиримидиновых сайтов и однонитевых разрывов ДНК мононуклеаров периферической крови. Причем степень указанных процессов находится в зависимости от клинического течения ВИЧ-инфекции. В свою очередь, образование однонитевых разрывов является стимулирующим фактором повышения активности ксантиноксидазы в мононуклеарах, а образующиеся олигонуклеотиды могут служить факторами активации экспрессии провирусного генома ВИЧ. интегрированного в ДНК мононуклеаров периферической крови. В результате формируется патологический круг. способствующий репликации ВИЧ (рис.1, в конце).

Описанные процессы, среди которых наиболее значимым является свободнорадикальное окисление, сопровождаются характерными изменениями системы белков теплового шока в мононуклеарах периферической крови, происходящими в тесной связи с клиническим течением ВИЧ-инфекции. Указанные изменения БТШ-70 в неинфицированных клетках могут быть опосредованы влиянием вирусного белка gplZO. взаимодействие которого с рецептором CD4 не только вызывает стрессовую реакцию. проявляющуюся рядом функциональных изменений, в том числе и усилением транскрипции с генов БТШ-70 (G.Furlini at al.. 1994).. но и приводит к программированной клеточной гибели - апоптозу зрелых СD4+-лимфоцитов или СD34+-гематопоэтических клеток-предшественников (Hofman Во, 1991; Montagnier L. et al., 1992). В инфицированных клетках экспрессия генов ВИЧ и генов, кодирующих синтез БТШ-70. осуществляется по общим механизмам с участием ядерного фактора NF-kB (Krumm A. et al.. 1993).

Таким образом, и в неинфицированных, и в инфицированных ВИЧ иммунокомпетентных клетках крови больных показатели семейства БТШ-70 могут обоснованно рассматриваться в качестве индикатора активности репликативного процесса вируса, формирования вторичного иммунодефицита (вследствие дисфункции и гибели СБ4+-клеток) и развития клинического течения болезни.

ВЫВОДЫ

1. Традиционные для оценки иммунного статуса лабораторные показатели (количество CD3+. CD4+. С08+-лимфоцитов. В-лимфоцитов. несущих Ig М, G. А; РТМЛ с КонА; концентрация Ig M, G. А; содержание циркулирующих иммунных комплексов) недостаточно полно отражают динамику перехода ВИЧ-инфекции из бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

2. Повышение активности 0-формы ксантиноксидазы и интенсивности процессов свободнорадикального окисления в мононуклеарах периферической крови прогрессируют в динамике заболевания, при этом достоверные различия (р<0,05 и р<0.01 соответственно) наблюдаются только при переходе от бессимптомной фазы к персистирувщей генерализованной лимфаденопатии.

3. При развитии ВИЧ-инфекции наблюдается увеличение относительной доли продуктов деградации хроматина (уровня полидезоксинуклеопротеидов) и интенсивности образования однонитевых разрывов ДНК в мононуклеарах периферической крови без достоверных различий в динамике болезни (р>0,05).

4. Белки теплового шока семейства БТШ-70 индуцируют образование поликлональных антител высокой специфичности и аффинности, распознающих один или несколько смежных сайтов на нативных молекулах белков, что исключает возможность использования полученных иммуноглобулинов в конструкции иммуноферментных тест-систем для количественного определения БТШ-70. но допускает их применение в методе иммуноблотинга.

5. При переходе клинического течения заболевания от бессимптомной фазы к персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний происходит достоверное увеличение содержания конститутивной изоформы семейства БТШ-70 в мононуклеарах периферической крови, характеризующее пребывание иммунокомпетентных клеток в состоянии хронического стресса (р<0.05).

6. Функциональное истощение системы БТШ-70 мононуклеаров периферической крови ВИЧ-инфицированных проявляется снижением интенсивности ответа (синтез индуцибельной изоформы БТШ-70) на стрессорные воздействия в виде гипертермии и ультрафиолетового облучения.

7. Динамика изменений белков теплового шока семейства БТШ-70 в совокупности с показателями свободнорадикального окисления и системы ксантиноксидазы мононуклеаров периферической крови соответствует клиническому развитию ВИЧ-инфекции, что позволяет использовать их для прогнозирования перехода клинического течения заболевания из бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии (ПГЛ) и от ПГЛ к стадии вторичных заболеваний.

ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ

Предложенный способ оценки функционального состояния системы белков теплового шока мононуклеаров периферической крови с применением стрессорных воздействий - гипертермии и ультрафиолетового излучения - целесообразно использовать в экспериментальных исследованиях, направленных на изучение патогенеза вторичных иммунодефицитных состояниях при ВИЧ-инфекции и других инфекционных заболеваниях.

Комплекс показателей, отражающих состояние семейства белков теплового шока БТШ-70 (повышение содержания конститутивной изофор-мы hsc-70 более 68,9 у.д.е.) и системы ксантиноксидазы (повышение активности 0-формы более 1,03 мкмоль/мг белка-мин) мононуклеаров периферической крови, в совокупности с традиционными показателями иммунного статуса может быть использован для прогнозирования перехода клинического течения ВИЧ-инфекции бессимптомной фазы в фазу персистирующей генерализованной лимфаденопатии. Для перехода ПГЛ в стадию вторичных заболеваний характерно повышение содержания конститутивной изоформы hsc-70 более 74,1 у.д.е. Включение указанных методов в комплексное лабораторно-диагностическое обследование больных ВИЧ-инфекцией позволяет прогнозировать клиническое течение заболевания.

Список работ, опубликованных по теме диссертации

1. Приготовление специфических поликлональных антител к белкам теплового шока // Мат. XI науч. конф. молодых ученых и специалистов академии.- Л.:ВМедА, 1990.- С.18-19.

2. The characterization and use of different antibodies against the hsp70 major heat shock protein family for the development of an Immunoassay // Electrophoresls.- 1991.-N12.-P.670- 673 (coавт. Б.А.Маргулис и др.).

3. The state of HSP-70 in lymphocytes In transition of HIV Infection to the clinical manifestation stage // Social and medical problem of AIDS.- St.-Petersburg. 1994.- P. 14 (соавт. Л.А.Кожемякин и др.).

4. HSP-70 state significance In the diagnosis and prognosis HIV-Infection // AIDS. cancer and related problems.- St.-Petersburg, 1996.- P. 130-131 (соавт. Е.И.Змушко).

5. Лабораторный контроль донорской крови в целях безопасности по ВИЧ-инфекции // Актуальные вопросы гематологии и трансфузиологии.- СПб. 1996.- С. 67 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

6. Диагностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Новые информационные технологии в медицине и экологии. -Гурзуф. Ялта, 1996.- С. 56 (соавт. Е.И.Змушко).

7. Прогностическое значение белков теплового шока при ВИЧ-инфекции // Инфектология. Достижения и перспективы. -СПб: ВМедА, 1996.-С.99 (соавт. Е.И.Змушко и др.).

Скачали данный реферат: Nefjod, Щуров, Kvasov, Никерхоев, Ananij, Баренцев.
Последние просмотренные рефераты на тему: реферат по обж, реферат на тему язык, курсовая работа 2011, диплом на заказ.

Предыдущая страница реферата | 1  2