Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4  5  6  7  8 | Следующая страница реферата

В практике генной инженерии широко распространен и третий метод искусственного получения генов, основан­ный на их ферментативном синтезе с помощью механизма обратной транскрипции. Этот механизм связан с актив­ностью РНК-зависимой ДНК-полимеразы или обратной транскриптазы — фермента, впервые обнаруженного при исследовании репликации  РНК  онкогенных вирусов. Фермент способен строить ДНК-копии на разных РНК, включая синтетические полирибонуклеотиды. С по­мощью обратной транскриптазы, называемой иногда ревертазой, можно синтезировать практически любой ин­дивидуальный ген в присутствии соответствующих иРНК, методы выделении которых достаточно разработаны. В 70-е годы появились методы выделения в чистом виде фрагментов ДНК с помощью электрофореза. В руки ученых попали "молекуляр­ные ножницы". Транспортным средством переноса генетической ин­формации в клетку стал вирус. Явление трансдукции — переноса ге­нов из одной клетки в другую с помощью вирусов изучали еще с 50-х годов. Но вирус не должен был сразу уничтожать всю клетку, поэтому не все вирусы подходили для этой роли. Известно, что бак­териальные клетки могут обмениваться генетическим материалом при помощи плазмид (небольших частиц с фрагментами ДНК). Поэтому введение нужного гена в плазмиду позволяет в дальнейшем перенес­ти этот ген в бактерию (это еще один из механизмов транспорта в генной инженерии). Появилась возможность изучать распределение нуклеотидов в оп­ределенном гене или получать нужный белок. Для этого создается рекомбинантная ДНК, которая возникает, когда ДНК одного орга­низма внедряется в клетки другого. В качестве последнего использу­ются клетки организма, который размножается много быстрее пер­вого, например, бактерии. Так, в 80-е годы были разработаны интерфероны ~ белки, способные подавлять размножение вирусов. Были выбраны наиболее подходящие для переноса гены и мобиль­ные участки ДНК. Например, культурным растениям вводят гены, повышающие их иммунитет и устойчивость.

В 1983г. Барбара Мак-клинток при изучении генетики кукурузы обнаружила в ее геноме один "подвижный" ген, отвечающий за цвет початка. Независимо от нес подвижные гены были открыты методами молекулярной генетики советским ученым Г. П. Георгисвым. В 1981 г. процесс выделения генов и получения из них различных цепей был автоматизирован.

При всем разнообразии методов основная схема любой генно-инженерной работы остается неизменной. Она включает:

обработку кольцевой векторной моле­кулы рестриктазой с образованием линейной формы ДНК;

сплавление ее с фрагментом чужеродной ДНК, веду­щее к формированию гибридной структуры;

 введение гибрида в клетку реципиента;

 отбор клонов транс­формированных клеток на селективных средах;

 до­казательство присутствия рекомбинантной ДНК в этих клонах путем ее выделения из клеток, обработки соот­ветствующими рестриктазами и анализа образовавшихся фрагментов методом электрофореза в агарозном геле.

Известно несколько методов объединения фрагментов ДНК из разных источников, позволяющих включить кло­нируемую донорную ДНК в состав вектора. Один из них основан на соединении фраг­ментов, каждый из которых несет идентичные «хлипкие» концы, полученные под действием одной и той же рестриктазы. При другом методе, ферментативном, используется возможность соединения двухцепочных концов фраг­ментов ДНК с помощью ДНК-лигазы. Для повышения эффективности лигазы к концам сшиваемых фрагментов ДНК химически присоединяют комплиментарные однонитивые олигонуклеотиды, например поли-А и поли-Т, создавая тем самым искусственные «липкие» концы.

Методы введения рекомбинантных молекул в клетки зависят от особенностей самих клеток и используемых векторов. В тех случаях, когда векторами служат плазмиды, рекомбинантные ДНК вводят в реципиентные бак­терии путем трансформации. Разработаны и методы транс­формации клеток животных, а также протопластов расте­ний. Для защиты экзогенного клеточного материала, вво­димого в клетки млекопитающих или в протопласты растений, используют липосомы — сферические тельца, обо­лочка которых состоит из фосфолипидов. В составе липосом в клетки высших эукариот введены крупные вирусные РНК. Во всех случаях липосомы надежно защищали молекулы нуклеиновых кислот от разрушения нуклеазами.

Один из путей передачи генетической информации в культуре клеток человека, животных и растений — гибридизация соматических клеток, разработанная Б. Эфрусси и Г. Барски (1960). Эффективность этого метода значительно повысилась после того, как было обнаружено, что частицы инактивированного вируса парагриппа типа Сендай увеличивают частоту слияния клеток из самых разных источников. Показана возможность передачи генов из изолированных хромосом китайского хомячка в клетки соединительной ткани мыши. Описаны гибриды клеток человека и мыши, из которых часть хромосом человека удаляется, а часть остается функционально активной. Для введения ДНК в различные культуры клеток млеко­питающих или развивающиеся эмбрионы используют метод микро инъекций ДНК в ядро с помощью микро­манипулятора. Развитие методов микрохирургии клеток позволило заменять ядра оплодотворенных яйцеклеток на ядра из соматических клеток и в результате получать абсолютно идентичные организмы. Создание гибридов высших растений в обход полового скрещивания возможно путем слияния протопластов и соматической гибридизации растительных клеток, в результате чего в ряде случаев появляются целые гибридные растения. Все эти методы могут быть использованы для конструирования новых форм микроорганизмов, животных и растений путем введе­ния и стабильного наследования в них рекомбинантных ДНК, несущих, гены, детерминирующие желаемые признаки.[4]

Следует, однако, отметить, что, несмотря на очевидные успехи подобных работ по созданию микроорганизмов, синтезирующих ряд важных продуктов эукариотического происхождения, проблема экспрессии чужеродных генов у прокариот имеет ряд ограничений. Некоторые из них связаны с тем, что при сверхпродукции полезных для человека и не нужных клетке соединений, кодируемых гибридной плазмидой, усиливается неустойчивость самих гибридов и вероятность элиминации из них встроенных генов. Стабильность гибридных ДНК снижается и с уве­личением размеров вставки в вектор. Поэтому разраба­тываются методы, направленные на сохранение целостнос­ти гибридной структуры. Использование регулируемых промоторов предохраняет клетку от чрезмерной для нее метаболической активности, связанной с избыточной про­дукцией чужеродного белка. Вместе с тем проблема ста­бильности гибридных молекул окончательно не решена. Ограничения возможностей конструирования микроорга­низмов — гиперпродуцентов ценных препаратов — рас­пространяются на случаи клонирования и экспрессии лю­бых генов как про -, так и эукариотического происхожде­ния.

Наряду с этим существуют и ограничения, специфи­чески связанные с выражением эукариотических генов в прокариотах.

Первое из них определяется тем, что эукариотические промоторы могут не распознаваться бакте­риальной РНК - полимеразой.

Второе заключается в том, что и РНК транскрибирующаяся с эукариотических генов, не содержит последовательности Шайн—Далгарно, необ­ходимой для ее связывания с рибосомами.

В-третьих, такая иРНК может содержать интроны, которые следует вырезать.

Наконец, эукариотические белки часто стано­вятся субстратами для бактериальных протеаз, опознаю­щих такие белки как чужеродные.[4].

Первые два ограничения преодолеваются за счет создания векторов, несущих соб­ственные промоторы и последовательность Шайн—Дал­гарно, третье можно обойти путем использо­вания кДНК либо химически синтезированных генов. Протеазная активность реципиентных бактерий подавляется мутациями.

Преодоление всех этих ограничений открывает даль­нейшие перспективы использования методов генной инже­нерии при создании микроорганизмов — продуцентов гор­монов, вакцин, антисывороток и ферментов, представляю­щих интерес для медицины, ветеринарии, сельского хо­зяйства и микробиологической промышленности.

Генетическая рекомбинация in vitro

Генетическая рекомбинация заключается в обмене генами между двумя хромосомами. По определению, данному Понтекорво в 1958 г., рекомбинация—это любой процесс, способный привести к возникновению клеток или организмов с двумя или более наследственными детерми­нантами, по которым их родители различались между собой и которые соединены новым способом. Такая рекомбинация обязательно происходит у млекопитающих при образовании половых клеток. В ходе мейоза гомологичные хромосомы обмениваются генами; именно эти обмены позволяют объяснить перетасовку наследственных признаков в ряду поколений. У вирусов и бактерий генетическая рекомбинация проис­ходит реже, чем у животных. Обмен генетическим матери­алом, за которым следует рекомбинация, происходит между организмами одного и того же или близких видов. Все живые организмы обладают рестрикционными эндонуклеазами, которые узнают чужеродную ДНК, проник­шую в организм, и расщепляют ее, таким образом сводя на нет генетическую рекомбинацию между эволюционно удаленными геномами.

Обмен генами, равно как и введение в клетку гена, принадлежащего другому виду, можно осуществить по­средством генетической рекомбинации in vitro. Этот подход был разработан на бактериях, в частности на кишечной палочке, в клетки которой вводили гены животных и человека и добивались их репликации.

Метод рекомбинации in vitro заключается в выделении ДНК из разных видов, получении гибридных молекул ДНК и введении рекомбинантных молекул в живые клетки с тем, чтобы добиться проявления нового признака, например синтеза специфического белка.

Выделение генов, которые представляют собой сегмен­ты ДНК, осуществляется на основе биохимических мето­дов; сложность выделения зависит от величины генома. В то время как определенный ген вируса выделить относи­тельно просто, для гена человека это очень сложная задача. Поэтому исследователи прибегают к косвенному методу, основанному на выделении информационной РНК (мРНК). В клетках животных транскрипция мРНК на ДНК осуществляется в клеточном ядре; молекулы мРНК переносят информацию из ядра в цитоплазму, где она используется при трансляции белков, аминокислотные последовательности которых закодированы в последова­тельностях нуклеотидов мРНК

(т. е. в конечном счете в ДНК). В клетках бактерий (прокариот), которые не имеют ядра, транскрипция и трансляция происходят одновремен­но и сопряжены; мРНК связана с рибосомами, в которых осуществляется соединение аминокислот с образованием белков. Рибосомы играют ключевую роль в трансляции и в клетках животных.

Наряду с информацией о структуре белков (записанной с помощью генетического кода) молекула ДНК содержит ряд регуляторных сигналов, записанных в виде специфи­ческих нуклеотидных последовательностей. Эти сигналы служат точками начала транскрипции или трансляции, другие (в частности, между генами) указывают точки прекращения считывания генетической информации. Гене­тический код, по-видимому, универсален для всех живых организмов, иными словами, данная последовательность ДНК обязательно кодирует один и тот же белок в клетках разных организмов, тогда как регуляторные сигналы в клетках животных и в бактериальных клетках не одинако­вы. В клетках животных информация о структуре белка может кодироваться не одним непрерывным участком ДНК, а несколькими сегментами, разделенными участка­ми ДНК, носящими название нитронов. Информационная РНК, которая транскрибируется с ДНК, подвергается расщеплению, в ходе которого все интроны удаляются из ее последовательности, а остальные остающиеся фрагмен­ты, или экзоны, сшиваются вместе с образованием моле­кулы мРНК, которая обладает последовательностью, ко­дирующей последовательность аминокислот белка, а так­же содержит ругуляторные сигналы, необходимые для начала и прекращения процесса трансляции.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: реферат федерация, дипломная работа проект.





Предыдущая страница реферата | 1  2  3  4  5  6  7  8 | Следующая страница реферата