Предыдущая страница реферата | 2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12 | Следующая страница реферата

7.1.2.4.Твердофазное культивирование микроорганизмов

Культивирование мицелиальных грибов в твердой фазе проводили в кюветах емкостью 0,5 л и бутылях емкостью 30 л.

Содержание среды в кюветах-250 г, в бутылях-2,5 кг.
Перемешивание осуществляли вручную: в кюветах-шпателем, в бутылях встряхиванием. Периодичность перемешивания и остальные условия оговариваются особо.

Культивирование мицеллиальных грибов проводилось на специально разработанных средах, представляющих собой измельченную древесину, инпрегнированную ароматическими веществами и увлажненную раствором солей и сахаров. Объем увлажняющей жидкости составлял 200-
400 мл на 1 кг древесины.

Посевной материал для кювет выращивали на чашках Петри на тех же средах. Чашки Петри засевали суспензией спор, полученной путем смыва увлажняющей жидкостью с газона 7-суточной культуры на агаре
Чапека. Для засева бутылей использовали содержимое кювет, во всех случаях посевной материал вносился в количестве 10% от объема ферментационной среды.

7.1.2.5.Фотолитическая обработка субстратов

Субстраты помещали в кюветы, которые располагались под источником излучения на расстоянии 50-60 см. Чтобы избежать перегрева поверхности субстрата, лампа работала периодически, не более 4 часов в течении рабочего дня.

В качестве источника излучения использовали газоразрядную лампу ПРК-7 ((max=257,3 нм).

7.1.2.6.Определение ПАУ в твердой фазе

Экспериментальные образцы подвергались сушке в термостате при
105ОС до постоянного веса.

Экстракцию ПАУ осуществляли в аппарате Сокслета в течении 6 часов. В качестве экстрагента использовали предварительно очищенный от примесей углеводородов гексан.

Полученный экстракт упаривали до небольшого (4-5мл) объема.
Затем в него добавляли около 1г активированного силикагеля
(Silpearl) и упаривали досуха. Далее пробу вносили в разделительную колонку с силикагелем и вымывали посторонние примеси 40мл гексана.
Затем элюировали фракцию ПАУ 120мл смеси гексан:хлористый метилен
(4:1). Фракцию, содержащую ПАУ упаривали до объема 0,25-1,0мл.

Газхроматографический анализ сконцентрированных компонентов проводили на хроматографе ’’Цвет-570М’’ с пламенно-ионизационным детектором на кварцевой капиллярной колонке (30м, 0,25мм) с неподвижной фазой DB-5 при программном повышении температуры от 70 до 320ОС со скоростью 4ОС в минуту. Количественные данные получали методом абсолютной градуировки детектора стандартными растворами
ПАУ (’’Экрос’’, Санкт-Петербург). Градуировку по бенз[а]пирену осуществляли при помощи ГСО 7064-93.

Идентификацию компонентов смеси осуществляли хромато-масс- спектрометрически на приборе LKB-2091 фирмы LKB-BROMMA (Швеция).
Хроматографические условия были те же, что и в случае количественного анализа. Идентификацию проводили путем сравнения масс-спектров электронного удара при помощи компьютерной информационно-логической системы ’’Компас-МС’’.

7.2.Результаты и обсуждение

7.2.1.Направленный поиск микромицетов-деструкторов ПАУ

Микробная деструкция экотоксикантов в последние десятилетия стала объектом интенсивных исследований практически во всех развитых странах мира. Эффективность этого процесса определяется в первую очередь активностью штамма-деструктора экотоксикантов.
Необходимость интенсифицировать процессы биоремедиации побуждает исследователей как к проведению селекции коллекционных штаммов, так и к поиску новых деструкторов /44-46/.

Проведенные эколого-таксономические исследования показали, что представители микрофлоры лесной подстилки (рода Alternaria,
Cladosporium, Helmintosporium-подобные, Chaetomium и др.), а так же почвенной микрофлоры ( рода Aspergillus, Trichoderma, Penicillium и др.) способны разлагать лигниноцеллюлозу и разрушать ароматические ядра лигнина /34/.

Фитопатогенные грибы так же способны разрушать природные аромитические вещества (Fusarium) /34/.

Обычно для выделения штаммов, разлагающих то или иное вещество, используют жидкие или агаризованные среды, содержащие это вещество как единственный источник углерода и энергии. Однако, по нашему мнению, для биоремедиации следует использовать микроорганизмы, сочетающие в геноме способность утилизировать как экотоксикант, так и целлюлозу, которая содержится в почве и является основным компонентом твердых отходов. Мы решили, что наилучшей средой для отбора микромицетов, разрушающих ПАУ в соокислительных условиях будет среда Чапека с целлюлозой и ПАУ. В качестве критерия отбора использовали общепринятый метод оценки роста культур мицеллиальных грибов по характеристике их роста в баллах через определенные, одинаковые для всех штаммов периоды времени. Такая методика позволяет отобрать наиболее резистентные и быстрорастущие штаммы.

Для выделения ПАУ-резистентных целлюлолитиков из природных биоценозов на наш взгляд наиболее подходит среда модифицированная
Ван-Итерсона /42/, где полоска фильтровальной бумаги была инпрегнированна ПАУ. На такой среде селективно отбираются ПАУ- резистентные микроорганизмы. Для отработки методики и с целью поиска штаммов-деструкторов ПАУ нами из техногенных биоценозов был выделены ряд микроорганизмов.

Из биоценоза свалки старых телеграфных столбов было отобрано
5 проб древесины, имеющей ярко выраженные биоповреждения. Пробы помещали в стерильные пробирки с ватно-марлевыми пробками высушивали и хранили при обычных условиях.

Выделение первичной культуры велось на модифицированной среде
Ван-Итерсона. Для устранения посторонних микроорганизмов образец короткое время обжигали в пламени спиртовки и помещали на питательную среду. Микроорганизмы, находящиеся на поверхности, гибли, а те микробы, которые находились внутри образца сохраняли жизнеспособность. Продолжительность инкубации составляла 60 суток, температура поддерживалась на уровне +25ОС.

Идентификация велась на сусло-агаре и среде Чапека. Было выделено и идентифицировано 5 штаммов: Trichoderma linorum,
Trichoderma sp. и три представителя рода Fusarium. Хранили штаммы на модифицированной среде Ван-Итерсона. Во избежании путаницы штаммам были присвоены музейные номера (см. табл.3. ). таблица 3
|№ | видовое | музейный номер* |
|п.п. |название | |
| |штамма | |
|1 |Trichoderma linorum | |
| | |Н-1 |
|2 |Trichoderma sp. | |
| | |Н-2 |
|3 |Fusarium sp. | |
| | |Н-3 |
|4 |Fusarium sp. | |
| | |Н-4 |
|5 |Fusarium sp. | |
| | |Н-5 |

*Н- Новгородский рег., 1- порядковый № штамма

Для проведения исследований мы использовали культуры, выделенные из техногенных биоценозов, а так же коллекционные, любезно предоставленные Оследкиным Ю.С. (разд. ). Отбор штаммов оcуществляли на среде Чапека с целлюлозой и ПАУ (содержание ПАУ 5% от массы целлюлозного субстрата). Оценка роста производилась визуально. Результаты представлены в таблице 4.

таблица 4
| | |коллекцион-|колонизация поверхности |
|№ |название | |субстрата, % |
| | |ный/музейны| |
| | |й | |
|п.п.|штамма | номер | время инкубации, |
| | | |сутки |
| | | штамма |3 |6 |9 |12 |15 |20 |
|1 |Trichoderma lignorum | 32 |0 |0 |2 |4 |2 |2 |
|2 |Trichoderma lignorum | 37 |0 |10 |30 |45 |60 |60 |
|3 |Trichoderma lignorum | 48 |0 |0 |10 |10 |10 |10 |
|4 |Trichoderma linorum | Н-1 |0 |0 |10 |15 |15 |20 |
|5 |Trichoderma sp. | Н-2 |0 |5 |10 |10 |10 |10 |
|6 |Chaetomium elatum | 341 |0 |2 |4 |4 |8 |4 |
|7 |Chaetomium bainieri | 344 |2 |2 |2 |4 |2 |2 |
|8 |Chaetomium funicolum | 347 |0 |4 |4 |6 |4 |2 |
|9 |Chaetomium coclioides | 491 |0 |0 |4 |6 |6 |2 |
|10 |Coriolus versicolor | 330 |0 |0 |6 |8 |2 |2 |
|11 |Fusarium solani | 464 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |
|12 |Fusarium solani | 496 |0 |0 |2 |2 |2 |2 |
|13 |Fusarium sp. | Н-3 |0 |0 |4 |6 |6 |6 |
|14 |Fusarium sp. | Н-4 |0 |2 |6 |8 |8 |8 |
|15 |Fusarium sp. | Н-5 |0 |0 |6 |6 |6 |6 |

Практически все исследуемые микроорганизмы обладали способностью расти и образовывать колонии на поверхности субстрата.
Однако у большинства культур процент заселения поверхности субстрата был незначителен (до 10%). По-видимому таким культурам требуется более длительный срок адаптации или наличие стимуляторов роста. Наибольшей скоростью роста и высокой степенью колонизации
(до 60% площади субстрата) обладал штамм Trichoderma lignorum №37.
Характер роста данного микроорганизма соответствовал каталожному описанию и заключался на начальных этапах в образовании небольших колоний диаметром 1-1,5 мм, постепенно сливающихся в единое целое и формирующих поверхностный мицелий светло зеленого цвета. Этот штамм и был отобран для дальнейших исследований.

7.2.2.Микробная деструкция смеси ПАУ

Анализ литературных данных показал, что основная масса работ по деструкции ПАУ посвящена изучению деструкции одного вещества или смеси ПАУ/6,11,14/, содержащей не более 5 компонентов. Однако в реальных условиях спектр ПАУ-экотоксикантов гораздо шире. Данные по деструкции многокомпонентных смесей ПАУ в доступной литературе отсутствуют. Между тем изучение процессов деструкции смеси экотоксикантов имеет очень важное значение для разработки процессов биоремедиации.

Для изучения деструкции смеси ПАУ нами в качестве модельного субстрата была выбрана древесина шпал. Использование этого субстрата значительно упрощало работу так как отпадала необходимость работать с креозотом непосредственно.

Для приготовления ферментационной среды субстрат измельчали до фрагментов размером около 5 мм и увлажняли жидкой средой Чапека с сахарозой (см.разд.7.1.). Посевной материал выращивали в чашках
Петри на такой же среде. Объем ферментационной среды составлял
250гр., посевной материал вносился в количестве 10-ти % от объема среды. Температура культивирования составляла 25оС, пробы отбирались на 14-е и 20-е сутки инкубации. Содержание ПАУ в экспериментальных образцах определяли методом хромато-масс- спектроскопии (см.разд.7.1.). Результаты анализа представлены в таблице 5: таблица 5
| | содержание ПАУ в образцах, |
|вещество |мг/кг |
| | контроль| 14 суток | 20 суток |
|Нафталин | 22 | 0,4 | 0,1 |
|Аценафтен | 7 | 2,2 | 0,4 |
|Аценафтилен | 86 | 1,5 | 0,4 |
|Флуорен | 86 | 3,1 | 2,9 |
|Фенантрен | 1840 | 87 | 43 |
|Антрацен | 600 | 24 | 12 |
|Флуорантен | 1430 | 350 | 210 |
|Пирен | 520 | 100 | 71|
|Бензантрацен | 230 | 8 | 2,7|
|Хризен | 160 | 22 | 15|
|Бенз(b)флуоранте| 45 | 12 | 4,3|
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте| 34 | 3,6| 27|
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |35 |5,9 |2,8 |
|Дибензантрацен |18 |2,7 |4,4 |
|Бензперилен |10 |4,7 |21 |
|Инденопирен |9 |3,4 |16 |

Анализ экспериментальных данных по деструкции ПАУ, приведенные в табл.45 показал, что различные по строению ПАУ разрушаются Trichoderma lignorum с различной скоростью. Простые
ПАУ, такие как нафталин, антрацен, фенантрен в большей степени подвержены деструкции, чем многоядерные. Литературные /40/ данные свидетельствуют, что микробная деструкция нафталина ферментами оксигеназами происходит последовательно и начинается с гидроксилирования только одного аромтического кольца (см. рис.6.).

В соответствии с правилом последовательного окисления только одного ароматического кольца сложные 4х-5ти ядерные ПАУ в меньшей степени подвержены полному распаду. Необходимо отметить, что на момент отбора проб для анализа в субстратах под воздействием микробных ферментов происходят сложные процессы изменения количественного соотношения ПАУ. Возможно этот процесс обусловлен явлением конденсации частично окисленных углеводородов. Для проверки этой гипотезы были проведены эксперименты с увеличением срока культивации.

Исследования проводились с использованием ранее описанных методов и сред, однако были внесены некоторые изменения:

1.Применялись более крупные фрагменты, чем ранее. Линейные размеры фрагментов составляли 10х10х20 см (кубики).

2.При формировании среды в ферментационных емкостях объемом
10 литров было произведено разбавление пропитанных креозотом кубиков чистыми кубиками, щепой и опилками в соотношении 1:1.

Посевной материал вносился в количестве 10%. Температура инкубации составляла 28ОС. Субстрат периодически увлажняли разбавленным водопроводной водой неохмеленным пивным суслом (2% сахаров).

Культура Trichoderma lignorum № 37 активно колонизирует поверхность кубиков, причем начальное прикрепление и активное размножение начинается с чистых, не содержащих ПАУ кубиков. Такая последовательность, по-видимому, связана с адаптацией культуры и накоплением в среде активных ферментов. К исходу 20-х суток культура колонизирует до 70% поверхности субстрата.

Отбор проб производился на 30-е и 40-е сутки инкубации.
Определение содержания ПАУ в образцах проводили в соответствии с раннее указанным методом. Результаты анализа представлены в таблице
6:

таблица 6
| |содержание ПАУ в образцах, мг/кг |
|вещество | |
|держание ПАУ |контроль |30 суток |40 суток |
|Нафталин |7 |3,8 |0,42 |
|Аценафтен |16 |2,5 |1,1 |
|Аценафтилен |170 |1,7 |0,31 |
|Флуорен |337 |8,3 |0,91 |
|Фенантрен |797 |1230 |7,4 |
|Антрацен |303 |320 |2,1 |
|Флуорантен |619 |1450 |9,8 |
|Пирен |382 |630 |3,1 |
|Бензантрацен |94 |37 |7,9 |
|Хризен |50 |42 |3,8 |
|Бенз(b)флуоранте|5,5 |29 |0,87 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|23,5 |39 |0,94 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |15 |9,6 |0,29 |
|Дибензантрацен |3,5 |24 |0,99 |
|Бензперилен |10 |69 |0,32 |
|Инденопирен |1 |49 |1,3 |

Как видно из представленных данных на 30-е сутки процесса микробной деструкции сохраняется накопление ПАУ, отмеченное раннее.
Увеличивается количественное содержание инденопирена (контрольный образец-1 мг/кг, 30-е сутки- 49 мг/кг), бензперилена, дибензантрацена и бенз[к]флуорантена. По сравнению с раннее полученными результатами на 30-е сутки обнаружено дополнительное увеличение содержания бенз[в]флуорантена (в 5 раз), незначительное увеличение пирена, флуорантена и антрацена. Это объясняется перераспределением вещества между компонентами смеси ПАУ в процессе микробной переработки и меньшей скоростью деструкции, обусловленной переходом к более крупным фрагментам субстрата- кубикам.

По видимому для более полного разрушения ПАУ требуется более длительный срок ферментации. Результат анализов проб отобранных по истечении 40 суток убедительно показал, что только содержание инденопирена сохраняется на прежнем уровне (контрольный образец-1 мг/кг, 40-е сутки-1,3 мг/кг). Содержание всех остальных компонентов смеси к исходу 40-х суток резко снизилось и достигло минимальных значений. На 40-е сутки инкубации исчезает, отмеченное раннее явление накопления полиядернях компонентов смеси, связанное с конденсацией продуктов частичной деструкции.

Параллельно нами был изучен процесс деструкции смеси ПАУ грибом Phanerochaete chrysosporium. Этот микроорганизм является самым перспективным среди микромицетов деструктором ароматических ксенобиотиков, ему посвящено огромное количество работ. Однако сведений по деструкции им многокомпонентных смесей ПАУ в литературе так же не оказалось. В этой связи имело смысл изучить данный вопрос. В соответствии с раннее описанными методиками был изучен процесс деструкции ПАУ. В качестве субстрата использовали кубики, анализ содержания ПАУ проводили методом хромато-масс-спектроскопии.
Результаты исследования представлены в таблице 7.

Как следует из приведенных экспериментальных данных, гриб
Phanerochaete chrysosporium активно разрушает ПАУ. Причем важно отметить, что раннеее наблюдаемое явление перераспределения ПАУ сохраняется и в случае Phanerochaete chrysosporium (инденопирен, бензперилен, дибензантрацен). Вместе с тем к исходу 40-х суток содержание ПАУ в субстрате резко снижается.

Таким образом подтверждается принцип последовательного окисления ПАУ и общность механизмов деструкции этих веществ у различных микроорганизмов.

таблица 7
| |содержание, |
|вещество |мг/кг |
| |контроль |30 суток |40 суток |
|Нафталин |7 |2,1 |1,1 |
|Аценафтен |16 |1,2 |1,9 |
|Аценафтилен |170 |0,98 |0,54 |
|Флуорен |337 |2,9 |0,82 |
|Фенантрен |779 |790 |14 |
|Антрацен |303 |190 |5,4 |
|Флуорантен |619 |840 |210 |
|Пирен |382 |280 |64 |
|Бензантрацен |94 |23 |11 |
|Хризен |50 |30 |32 |
|Бенз(b)флуоранте|5,5 |5,7 |9,4 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|23,5 |36 |20 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |15 |4,4 |0,49 |
|Дибензантрацен |3,5 |8,3 |9,5 |
|Бензперилен |10 |17 |3,8 |
|Инденопирен |1 |21 |7,9 |

7.2.3.Применение облучения ((=257,3 нм) для предобработки ПАУ- содержащих субстратов

В природных условиях ПАУ разлагаются под воздействием комплекса многочисленных факторов: микробной деструкции климатических условий и некоторых других. Солнечный свет несомненно должен оказывать влияние на ПАУ. Для проверки этого предположения нами была создана лабораторная установка (рис.3.) с газоразрядной лампой ПРК-7 ((=257,3 нм). Кюветы с измельченными фрагментами пропитанной креозотом древесины (фрагменты 5 мм) помещали в кюветы и подвергали облучению. Во избежание перегрева поверхности субстрата установка работала периодически, не более 4-х часов в сутки. Пробы отбирали по истечении 16-ти и 20-ти часов облучения.
Анализ содержания ПАУ проводили по методике, описанной раннее.
Результаты экспериментов представлены в таблице 8: таблица 8
| |содержание, |
|вещество |мг/кг |
| |контроль |16 часов |24 часа |
|Нафталин |22 |0,26 |0,10 |
|Аценафтен |7 |0,58 |0,76 |
|Аценафтилен |86 |0,40 |0,52 |
|Флуорен |86 |14 |8,9 |
|Фенантрен |1840 |140 |93 |
|Антрацен |600 |24 |24 |
|Флуорантен |1430 |640 |110 |
|Пирен |520 |490 |27 |
|Бензантрацен |230 |3 |9,9 |
|Хризен |160 |24 |41 |
|Бенз(b)флуоранте|45 |24 |23 |
|н | | | |
|Бенз(k)флуоранте|34 |13 |14 |
|н | | | |
|Бенз(a)пирен |35 |7,3 |4 |
|Дибензантрацен |18 |5,8 |5,3 |
|Бензперилен |10 |16 |6,5 |
|Инденопирен |9 |14 |21 |

Из таблицы 8 видно, что под воздействием ультрафиолетового излучения происходит деструкция ПАУ. Зафиксировано снижение содержания нафталина, антрацена, флуорена и фенантрена в 10-20 раз.
Содержание аценафтилена уменьшилось в 170 раз. Аналогично ведут себя большинство компонентов смеси.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: реферат горы, реферат машины.





Предыдущая страница реферата | 2  3  4  5  6  7  8  9  10  11  12 | Следующая страница реферата