ВСЕСОЮЗНАЯ ОРДЕНА ЛЕНИНА АКАДЕМИЯ СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫХ НАУК имени В. И.
ЛЕНИНА

Всесоюзный научно-исследовательский институт информации и технико- экономических исследований по сельскому хозяйству

Обзорная информация М. А, ФЕДИН,Т. А. КУЗНЕЦОВА

ГАМЕТОЦИДЫ И ИХ ПРИМЕНЕНИЕ В СЕЛЕКЦИИ

[pic]

Москва — 1977

УДК е3.1.5В7ЛЗ

'Гаметоциды — химические соединения, применение .которых в определенные этапы развития растений приводит к гибели мужского гаметофи-та в результате нарушении метаболических процессов в период формирования пыльцевых зерен.
Действие гаметоцидов на физиолого-биохимиче-ские процессы в клетке аналогично стерилизующей цитоплазме при перемещении в нее ядра, что вызывает мужскую стерильность.
Исследования, проведенные в ряде стран, в том числе и в СССР, позволили выявить ряд химических соединений, которые индуцируют мужскую стерильность у яровой и озимой пшеницы, ржи и других сельскохозяйственных культур.
Использование гаметоцидов позволяет организовать Промышленное .производство гибридных семян зерновых и других сельскохозяйственных культур. Однако полученные гаметоциды вызывают ряд побочных нежелательных явлений: значительное ингибирование роста, задержку 'в прохождении .фенологических фаз и д'р. Поэтому необходим дальнейший поиск новых химических соединений, обладающих гаметоцид-ной активностью.

© ВИИИТЭИСХ, 1977 г.

ВВЕДЕНИЕ

|Рост народонаселения планеты, необходимость повышения темпов производства продуктов сельского хозяйства определяют поиск новых направлений в селекции сортов и гибридов — основных средств сельскохозяйственного производства. В последнее время широкие исследования гетерозиса пшеницы, ржи, ячменя, подсолнечника, сахарной свеклы, хлопчатника, ряда овощных, бахчевых, цветочных, декоративных культур и кормовых трав показали, что гибриды первого поколения этих растений обеспечивают прибавку урожая на 20—25% и более по сравнению с районированными сортами [1,7, 35, 36].

Практическое использование гетерозисного эффекта возможно лишь при условии хорошо налаженного производства гибридные семян в значительном объеме. У ряда культур, обладающих высоким коэффициентом размножения семян и низкой посевной нормой (кукуруза, томаты и др.), производство гибридных семян может быть организовано при ручной кастрации материнских растений с последующим свободным или принудительным опылением. Однако для большинства возделываемых растений этот метод неприменим, так как затраты труда, необходимые для получения гибридных семян первого поколения, не окупаются дополнительно получаемой продукцией.

В настоящее время в результате использования явления цитоплазматической мужской стерильности (ЦМС) получены гибриды первого поколения пшеницы, сорго, кукурузы, сахарной свеклы, томатов, лука, сладкого перца и налажено массовое производство гибридных семян. Близки к завершению исследования по созданию гибридов ржи и подсолнечника [35]. Наряду с этим при селекции с томатами пытаются применить формы с функциональной мужской стерильностью
[36]. 'Создание мужских стерильных линий, отбор линий — закрепителей стерильности и форм, восстанавливающих фер-тильность, значительно усложнили ведение селекции я семеноводства. Между тем основным недостатком использования системы «ЦМС — восстановление фертильноста» при получении новых гибридных комбинаций скрещиваний является постоянная необходимость создания стерильных аналогов и ана- логов '— восстановителей фертильности новых высокопродуктивных сортов и самоопыленных линий.
Сравнительно недавно для индукции мужской стерильности на растения в определенные фазы развития воздействовали различными физическими факторами
(сокращенный световой день, высокие и низкие температуры и др.) [2, 48, 97,
130]. Несмотря на полученные положительные результаты» ввиду отсутствия технических средств для массового производства гибридных семян эти приемы не были внедрены в практику.
•Определенные успехи в разработке методов мужской стерильности растений были достигнуты с помощью ряда химических соединений — растворов солей феноксиуксусной кислоты, гидразида малеиновой кислоты (ГМ1К), этрела, индо- лилуксусной кислоты (ИУК), нафтнлуксусной кислоты (НУК), гиббереллина
(ГКз) и некоторых других, названных гаметоцидами. Этот термин — производное от двух слов: гамета — по-гречески половая клетка, цидо — по-латински убивать. В настоящее время в ряде стран Европы и в США проводят исследования по выявлению химических соединений, обладающих гаметоцядной активностью к мужскому гамето-фиту растений, и разрабатывают способы их применения для массового производства гибридных семян различных сельскохозяйственных культур. Использование методов химической индукции мужской стерильности у зерновых, технических, овощных и кормовых культур позволит получить семена гибридов первого поколения, вовлекая в селекционный процесс наиболее совершенные сорта без создания их стерильных аналогов и линий, несущих гены восстановления фертильности.
Преодоление трудностей, препятствующих эффективному использованию гаметоцидов, в значительной мере зависит от определения сущности процесса стерилизации, в основе которого лежат конкретные физиолого-биохимические изменения в тканевом метаболизме спорогенеза, вызывающие анормальности в развитии пыльцевого зерна с последующей его абортивностью. В связи с практическими запросами физиология развития пыльцы привлекает особое внимание.
ЦИТОЛОГИЧЕСКИЕ, ЦИТОХИМИЧЕСКИЕ И ФИЗИОЛОГО-БИОХИМИЧЕСКИЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
ФОРМИРОВАНИЯ МУЖСКОГО ГАМЕТОФИТА
Мужской гаметофит покрытосеменных растений — микроскопическая структура, которая в период ранних стадий развития окружена тканями пыльника и непосредственно контактирует с клетками тапетума, метаболизм которых тесно связан с развитием пыльцевьгх зерен, особенно в критические периоды преобразования материнских клеток пыльцы в гап-лоидные микроспоры.
Так как наибольшая эффективность действия гаметоцидов приходится на период формирования тетрад и связана с биохимизмом их развития, возникает необходимость в детальной информации о ранних фазах развития пыльцевого зерна в материнской клетке пыльцы.
С помощью электронной микроскопии установлено, что до мейоза материнские клетки пыльцы в пыльниках связаны между собой и с клетками тапетума цитоплазматлческими мостиками (плазмодесмами) [5, 59]. Перед стадией лептотены профазы 1 начинаются преобразовательные процессы в оболочках и мембранах микроспороцитов, которые быстро обволакиваются слоем каллозы, представляющей собой (3-1,3-свя-занный полимер глюкозы [130]. Это соединение локализуется между оболочками материнской клетки пыльцы и клеточной мембраной. С началом стадии лептотены плазмодесмы, соединяющие клетки тапетума и микроспороцитов, исчезают. Слой каллозы продолжает утолщаться, однако некоторые районы оболочек микроспороцитов не покрываются каллозой, здесь соседние материнские клетки пыльцы контактируют друг с, другом с помощью широких цитоплазматичесиих перетяжек, названных цитомиксическими каналами [28]. У большинства видов растений все микроспороциты мейотической профазы взаимосвязаны. Такая цитоплазматическая общность — важнейший фактор поддержания тесной синхронности мейотических стадий. Цитомиксические каналы начинают исчезать к концу мейотической профазы I, а в телофазе I их количество совсем незначительно, к началу же профазы II материнские клетки пыльцы полностью изолируются друг от друга каллозными оболочками. После мейоза каллоза образует между четырьмя гаплоидными спорами тонкую прослойку (стадия тетрад), и каждая спора становится полностью изолированной от других. Предполагают, что в формирование каллозных оболочек вовлечен аппарат Гольджи [137].
Процесс формирования оболочки пыльцевого зерна начинается вскоре после завершения мейоза и протекает между клеточной мембраной я каллозной оболочкой в каждой споре тетрады. Первичным материалом для построения оболочки является примэкзина. После развития прдмэкзины синтезируется предшественник зрелой экзины, морфология которого .зависит от его химического состава. По своим свойствам это вещество сходно с протоспоруллином. На данном этапе кал-лозная оболочка исчезает, споры быстро увеличиваются в размерах (в 3—5 раз) и интенсивно синтезируют спорополле-нин [70, 71]. После освобождения из тетрад в микроспорах формируется интина, содержащая микрофибряллы целлюло-5 зы, которые образуют матрикс с пектиновым материалом, ге-мицеллюлозой и незначительным количеством белка. До полного созревания пыльцевое зерно покрывается различными производными распадающегося тапетума — каротиноидами, липидами, белками и другими соединениями [130]. При дальнейших фазах развития пыльцы эффективность действия га-метоцидов снижается [47, 65, 75, 80, 102].

Ранние этапы развития пыльцы тесно связаны с функциональной активностью тапетума. Цитохимические и ультраструктурные исследования свидетельствуют, что тапетум функционирует как источник питательного материала при развитии пыльцевого зерна. У покрытосеменных установлено два основных типа тапетума: гландулярный, при котором клетки по мере развития пыльцевых зерен дегенерируют до П9лного автолиза, и амебоидный [76]. В последнем клетки теряют свою оболочку, и протопласт тапетума распределяется между развивающимися пыльцевыми зернами, образуя тапетальный периплазмодий [61].
Мембраны такого тапетума могут проникать в экзину пыльцы. Питательный материал транспортируется из клеток та'петума (возможно, предварительно метабо-ли'аируется им) к пыльцевым зернам .[62]. Взаимодействие тапетума и развивающихся микроопор максимально проявляется при растворении каллозных оболочек микроспор. Исчезновение каллозы сопровождается развитием каллазной активности. Энзим локализован в везикулах цитоплазмы тапетума [130].

Исследование (3-1,3-глюканазной активности в течение мей-оза я распада тетрад показало, что активность энзима резко возрастала, начиная со II мейотдческого деления, достигала максимума в фазу освобождения микроспор из тетрад и сохранялась затем в течение 48 ч [82, 131]. Доказательством взаимосвязи между развивающимися пыльцевыми зернами и тапетумом, а также подтверждением кардинальной роли тапетума в образовании пыльцы служат работы по ЦМС [59, Gl, 62, 76].
В связи с тем, что применение гаметоцидов имеет целью индукцию мужской стерильности растений, для выяснения предполагаемых механизмов действия веществ с гаметоцид-'ной активностью необходима сравнительная оценка и анализ морфологических, цитологических и физиолого-биохимиче-ских различий фертильных растений и линий с ЦМС. Сравнительная анатомия и биохимия тканей пыльников нормальных и стерильных растений свидетельствуют, что абортивность развивающихся пыльцевь»х зерен является результатом включения или выключения более чем одного механизма, а также нарушений регуляторных процессов на различных уровнях 6 контролирования метаболических путей [62, 94, 98, 111]. Отмечено, что у всех изученных линий с ЦМС 90% растений обла^-дали нормальным ходом микроспорогенеза до определенной фазы, на которой начиналась абортивность пыльцы, и только у 10% растений анормальность проявлялась еще до стадии, обусловливающей абортивность в результате более ранних нарушений нормальных метаболических циклов. У большинства видов (около 70%) деградация микроспор приходилась на период, начиная с мейоза 1 и включая интерфазу микроспор
[94].

Одной из причин, вызывающих ЦМС растений, являются функциональные нарушения в метаболизме тапетума. Тщательное изучение этой ткани у фертильных и стерильных линий, а также у восстановителей фертильности сорго показало, что у фертильных линий после мейотической профазы I тапетум быстро уменьшался в радиальной протяженности [52]. В стерильных пыльниках радиально расширенный тапетум обусловливает абортивность микроспор, и период его разрастания приходится на стадию вакуолизации микроспоры.
Тапетум стерильных пыльников по протяженности (в ширине) и морфологии имеет более широкую шкалу изменчивости, чем у фертильных линий. 'Размеры ширины тапетума стерильных пыльников связывают с дегенеративными процессами в микроспорах [62, 109, 111].

•При цитологических исследованиях клонов ежи сборной с ЦМС не было отмечено отклонений в развитии пыльника в течение архиспориальной стадии и стадии материнской клетки пыльцы по сравнению с нормальными растениями [94,
117]. Первые признаки различий в развитии появлялись в начальные фазы мейоза, что выражалось в разрушении некоторых микроспороцитов, в результате чего образовывалось малое количество тетрад у растений с ЦМС. Одновременно у стерильных растений наблюдалось более быстрое дегенерирова-ние тапетума, чем у фертильных. При сравнительном исследовании микроспорогенеза и развития пыльцы у фертильных и стерильных растений льна установлено, что стерильность пыльцы у этого растения достигалась анормальным разрастанием клеток тапетума, которые медленно дегенерировали по сравнению с тапетумом фертильных растений, у которых величина этой ткани быстро уменьшалась, особенно после стадии тетрад. Очевидно, преждевременное или позднее включение деградативньгх механизмов тапетума может быть причиной функциональной мужской стерильности. У разных видов растений эти механизмы имеют свой специфический характер, что необходимо учитывать при подборе гаметоцидов, их доз и сроков обработки.
• Цитологические исследования пшеницы показали, что на клеточном уровне ЦМС выражается в уменьшении размеров и числа органелл, характеризующихся низкой физиологической активностью и довольно быстрым дегенерированием [59]. У фертильных пыльцевых зерен органеллы клеток обильны.

Различный уровень метаболической активности тапетума в нормальных и стерильных пыльниках и продолжительность его функционирования контролируется цитологами реакцией Фёльгена. Ядра клеток тапетума нормальных пыльников интенсивно окрашиваются до формирования материнской микроспоры, после чего окраска прогрессивно уменьшается по мере коллапсирования тапетума. В тканях тапетума стерильных пыльников окрашивание ядер продолжает осуществляться интенсивно после формирования тетрад и незначительно снижается в процессе развития микроспор [94].
Следовательно, функция тапетума неразрывно связана с его определенной ролью при абортивности микроспор. У нормальных пыльников тапетум получает необходимый питательный материал, поставляемый растением, и преобразует его для формирующихся микроспор, что подтверждается поступлением Фёль-ген- положительных веществ в материнскую микроспору во время мейоза [93].
Тапетум стерильных пыльников имеет более низкий уровень метаболической активности, о чем свидетельствует как низкая энзиматическая активность, так и изменение поступления Фёльген-положительного материала в спорогенные клетки в критические периоды их формирования.

В процессе 'химической индукции мужской стерильности может происходить включение тех же механизмов, что и пр.и абортивности мужского гаметофита стерильных аналогов, где стерильность обусловлена ЦМС. Обработка растений кориандра, вики и лука 0,01%-ным раствором ГМК вызывала 100%-ную стерильность у всех трех растений [60, 89, 90]. После нанесения гаметоцида на растения кориандра тапетум увеличивался и существовал вплоть до стадии вакуолизации микроспор. У контрольных растений тапетум дегенерировал после мейоза. У лука Г1МК, включался в процессы формирования пыльцы, способствуя преждевременному дегенерирова-нию спорогенной ткани и материнских клеток пыльцы. У кориандра химическое индуцирование мужской стерильности проявлялось цитологически — размер ядер не изменялся, а клетки тапетума значительно удлинялись.

Предполагают, что вмешательство различных факторов в метаболизм клеток тапетума приводит к деградации и'х содержимого и, в первую очередь, дезокоирибозидов — основ-
8 ного синтетического пула ДйК, необходимого для нормального развития материнской клетки пыльцы и микроспор. Нарушение деятельности тапетума при снабжеаии питательным ^материалом спорогенной ткани, вызванное различными причинами, обусловливает начало процессов деградации материнской клетки пыльцы [134, 137].
Цитологические исследования пыльников растений с аук-син-индуцированной стерильностью, выращенных при продолжительном освещении, показали, что химические и физические факторы могут способствовать преждевременному де- генерированию тапетума с последующим снижением нормального передвижения питательного материала к спорогенной ткани. В процессе нормального развития пыльцы в начальных (самых ранних) этапах микроспорогенеза ткани тапетума разрастаются и только после завершения формирования микроспор в материнской клетке пыльцы дегенерируют. При гормональной индукции мужской стерильности гиббереллином (ГКз) и в условиях длительного естественного освещения
•отмечена обратная корреляция во взаимодействии микроспор .и тапетума.
Большинство микроспор становятся крупными, сильно вакуолизированньши, с ядром, прижатым к клеточной .стенке. Клетки тапетума образуют плотную оболочку вокруг
•полости пыльцевого мешка. Часть микроспор дегенерирует до вакуолизации, но большее их количество абортируется при цветении [94].

Аберрация микроспорогенеза в результате продленного дня, по-видимому, связана с ранним распадом клеток тапетума. Подобный эффект может быть достигнут путем обработки ауксином, высокая концентрация которого обнаружена в тканях растений при длительном фотопериоде [78]. Это подтверждает гипотезу о влиянии фотопериода на пол путем регуляции метаболизма ауксинов в растительных тканях [84, 88].

Считают также, что нарушение функций тапетума в питании развивающихся микроспор не является непосредственной и единственной причиной абортивности пыльцы [46, 107].

При сравнительных исследованиях пыльцы и развития
•пыльников линий пшеницы с ЦМС и нормальных растений установлено, что деградативные процессы в развивающихся пыльцевых зернах начинаются с несбалансированного поступления питательных веществ в тапетум в результате нарушений функциональной активности васкулярной системы тычиночных нитей
[31, 32, 87]. Последние у стерильных растений имели слабо дифференцированные васкулярные тяжи (либо они отсутствовали), в то время как у нормальных тычинок сосудистые элементы были хорошо дифференцированы на

9 ксилему и флоему. Наблюдаемое снижение аккумулирования крахмала в тканях тапетума и отсутствие запасного крахмала в зрелых микроспорах является следствием редукции передвижения растворов (в частности углеводов) в тычинки стерильных растений [87]. Нарушение структуры васкулярных элементов при воздействии веществ с гаметоцидной активностью может быть одним из аспектов их действия, тем более, что обработка гаметоци.д'а'ми, как правило, сопровождается уменьшением размеров пыльников и длины тычиночных нитей [20, 59].

Преждевременное деградирование тапетума 'или. более длительное существование интактных клеток тапетума в пыльниках с мужской стерильностью, индуцированной химическими препаратами, по-видимому, является результатом взаимосвязи химически активных веществ с деградативными энзимами (несвоевременная их индукция или блокирование) [56,
60, 74].