Гаметициды и их применение в селекции

| Категория реферата: Рефераты по ботанике и сельскому хозяйству
| Теги реферата: создание реферата, доклад на тему
| Добавил(а) на сайт: Polichev.

При исследовании причин абортивности пыльцы установлено повышение активности кислых фосфатаз в тканях нормальных пыльников до стадии тетрад, после которой активность энзимтав резко снижалась с последующим дегенерирова-нием тапетума [56]. В тканях стерильных пыльников активность энзимов была гораздо ниже, и набухший тапетум раздавливал микроспоры [82].

.Подобный дисбаланс в энзиматической системе стерильных пыльников был отмечен S. Izhar и R. Frankel [82] при сравнительном изучении каллазной активности. В связи с тем, что период развития каллазной активности четко установлен во времени и имеет определенный оптимум кислотности (р.Н 5), авторы измерили in vivo pH различных стадий микроспорогенеза. У фертильных пыльников вплоть до поздней стадии тетрад р.Н составляла около 7, затем снижалась до 6, что сопровождалось растворением каллозы. В пыльниках растений линий с ЦМС pH обычно или низкая — тогда энзиматический распад каллозы материнской клетки пыльцы начинается раньше нормальных сроков, или высокая — тогда наблюдается сильная активность энзима, начиная с профазы 1 в течение всего мейоза, вызывая цитологические нарушения. Преждевременное повышение каллазной активности может быть причиной немедленного разрушения материнской клетки пыльцы. Торможение энэиматической активности кал-лазы блокирует распад каллозной оболочки материнских клеток пыльцы, в результате микроспоры теряют свои нормальные очертания и деградируют.

Эти исследования позволили выявить новые причины абортивности пыльцы и показали, что в основе индукции мужской
10 стерильности лежит дисбаланс в четко скоординированные биохимических реакциях и нарушения в последовательности -„.нзиматических циклов.
Изменение четкого ритма энзиматической активности каллазы приводит к деградации развивающихся микроспор [2, 3, 4]. Экспериментально установлено, что период формирования тетрад является наиболее эффективным для применения препаратов с гаметоцидной активностью.
.Возможное участие гаметоцидов в процессах, обусловливающих торможение или .преждевременное освобождение микроспор из материнской клетки пыльцы, вероятно, связано с влиянием соединений с гаметоцндными свойствами на уровни энзиматической активности каллазы. Своевременная индукция и развитие каллазной активности — критический период для нормального развития мужского гаметофита.
Для успешных поисков новых веществ, обладающих гаметоцидной активностью, необходимо располагать достаточной информацией о метаболизме спорогенной ткани и тапетума, а также о взаимосвязи вх обмена. Электронно- микроскопические наблюдения показали, что при нормальной метаболической взаимосвязи между клетками тапетума и развивающимися пыльцевыми зернами не наблюдается никаких аномалий [78]. Согласно имеющимся данным трудно определить, тапетум или спороциты являются 'инициатором -в нарушении взаимосвязи.
Одним из возможных путей выяснения механизма индукции мужской стерильности является исследование биохимической активности тканей. При исследовании пыльников и экстр-актов листьев пшеницы установлено, что мужская сте' рильность пыльцы сопровождается репрессией активности терминальных оксидаз. Уровень активности цитохромоксида-зы в тканях фертильных растений по сравнению со стерильными гораздо выше [18, 27].
Подобное явление отмечено в тканях растений с генетической мужской стерильностью [46]. Цитохромоксидаза — неотъемлемый компонент мито-хондрий, поэтому низкую активность дыхательных энзимов растений с ЦМС можно объяснить дисбалансом митохондри-альных энзиматических систем [128].
Митохондрии, выделенные из стерильного материала (проростки пшеницы с
ЦМС), характеризовались более высокой окислительной фосфорилазной активностью, чем мито-хондрии из проростков с нормальной цитоплазмой [129].
Биохимические исследования и наблюдения электронной микроскопии подтвердили, что мужская стерильность тесно связана с изменением функционального состояния этих структур клетки {15, 16, 63]. Восстановление фертильности в линиях

11 с ЦМ'С сопровождается одновременным устранением отклонений в структуре цитоплазматических органелл и различных нарушений в метаболических процессах [27, 46]. Получены дополнительные доказательства в подтверждение гипотезы, что изменения в метаболизме митохондрий связаны с механизмами индукции мужской стерильности. Предполагается, что включение последних вызывает репрессию синтеза белков внутренней мембраны митохондрий [63,
114].

Однако было бы ошибочным считать, что только функциональная активность митохондрий является основой возникновения цитоплазматической мужской стерильности. Ее индукция базируется на изменениях в широком диапазоне биохимических реакций, обусловливающих нарушения в молекулярных компонентах различных клеточных структур и цитоплазмы, что сопровождается появлением белков с анормальной эн-зиматической активностью. В результате этих изменений возникает дисбаланс в энзиматических системах или же полное их блокирование[8, 15, 20,82].

Для получения ЦМС путем химической индукции у сельскохозяйственных культур необходимо детальное изучение метаболизма ДНК, РНОК и белка в стерильном и фертильном материале с цитологическим и цитохимическим сопоставлением полученной информации. Изменения в содержании ДНК, РНК и белка в пыльниках кукурузы изучали методами цитохимии и микроденситометрии
[101]. В процессе спорогенеза различали три пика интенсивного синтеза нуклеиновых кислот. Первый пик соответствует премейотическому периоду и ранней профазе, второй — приходится на интервал между поздним мейозом и стадией тетрад, третий (наименьший) — соответствует периоду, предшествующему митозу микроспор. В течение первого пика установлена самая высокая скорость роста спорогенной ткани и тапетума при активном синтезе молекулярных компонентов в обеих тканях. Во втором пике активный синтез
ДНК, PlHiK и белка осуществляется в основном в тканях тапетума. Торможение роста и параллельно синтеза этих молекулярных структур в спорах начинается в период третьего пика, при дегенерировании тапетума. В настоящее время тапетум рассматривают как возможный источник предшественников нуклеиновых кислот для формирующихся микроспор, которые получают материал для синтеза в форме растворимых предшественников или в форме ДНК с низким молекулярным весом [111, 130].

Основная аккумуляция PlHiK в спорогенной ткани происходит в течение мейотической профазы, включая стадию па-хитены материнской клетки пыльцы. В тканях тапетума накопление РНК приходится на тот же период (профаза—зи-12 готена—пахитена) [98]. Таким образом, сразу после синтеза ДНК на ранних этапах спорогенеза до митоза в микроспо-пах продуцируется РНК спорогенной ткани, причем 75% пригодится на рибосомальную РНК — на формы 16S и 28S.
Аккумулирование форм p:PHiK 4S и 5S осуществляется иначе, чем основных форм pPlHK, и пик их аккумуляций наблюдается в конце интерфазы микроспор [112].
В пыльцевом зерне основной синтез PHiK, ДНК и белка происходит на более поздней стадии — после митоза в микроспорах. .В цитоплазме пыльцевого зерна синтез всех форм РНК полиостью прекращается в последние 48 ч формирования пыльцы [94]. Биосинтез нуклеиновых кислот и процессы, связанные с их обменом, претерпевают определенные изменения под влиянием соединений с гаметощидными свойствами.
Установлено, что у фертильных соцветий кукурузы интенсивный синтез ДНК осуществляется на ранних этапах мик-роспорогенеза, но по мере завершения формирования пыльцы наступает торможение синтетических процессов [20]. При обработке растений гаметоцидами (0,15%-ным раствором три-атаноламиновой соли ГМК или 0,8%-ным раствором натриевой соли сф-дихлоризомасляной кислоты
(FW-450), комбинированно 0,8%-ным раствором FW-450 и 0,1%-ным раствором гнббереллина) содержание ДНК на всех этапах формирования пыльцы несколько увеличилось независимо от применяемого гаметоцида. Это объясняется торможением клеточного растяжения под влиянием обработки гаметоцидами, в результате чего уменьшаются размеры клеток в спорогенной ткани и пересчет на взятую навеску дает завышенное содержание ДНК, не связанное с процессами аккумуляции нуклеиновых кислот [34].
Комбинированная обработка с гиббереллином (FW-450 + +гиббереллин) вызывает качественные изменения в молекулах ДНК, что приводит к нарушениям митозов и деградации ядра. Отмечено, что растворы ГМК и FW-450 по-разному влияют на интенсивность биосинтеза РНК в мужских репродуктивных органах кукурузы [26]. Параллельно было установлено, что формы проявления стерильности (морфологиче-ские_йзменения) находились в зависимости от применяемого вещества. Применение ГМК на кукурузе вызывало торможение образования РНК, и гаметоцид выступал здесь как ингибитор синтеза РН.К, обусловливая торможение клеточного удлинения. Морфологически это выражалось в уменьшении размеров соцветий, отсутствии в большинстве случаев колосков на латеральных веточках и в редукции листьев. Споро-генные ткани или совсем не формировали пыльцы, или она была нежизнеспособна. Действие FW-450 при данной концен-

13 трации'не вызывала значительных изменений в синтезе ДНК и PiHK, процессы спорогенеза у кукурузы протекали нормально [20, 26].
У фертильных растений высокое содержание PiHIK отмечено на более ранних этапах формирования пыльцы я дальнейший синтез РНК осуществлялся более активно [94, 98, 137].
Специфичность действия гаметоцида обусловлена различными факторам.и: близостью его химических характеристик к аналогам синтетических пулов клетки; возможностью энэиматического преобразования в клеточной системе в субстрат-подобный продукт ил;и в активный промежуточный метаболит определенных энздматических систем; наличием гормональных свойств или конформационного подобия с молекулами индукторов 'или репрессоров.
Воздействие препаратов с гаметоцидными свойствами связано с физико- химическими характеристиками соединений (высокая электрофильность, способность к хелатированию и т. д.), в результате которых могут изменяться р1Н клетки и 'ионная сила в критические стадии развития спорогенной ткани
[82].
Исследования влияния этрела на мейотические процессы в спорогенной ткани пыльников пшеницы Triticum aestivum L. показали, что индукция мужской стерильности связана с распадом этрела в растительных тканях с выделением этилена, молекулы которого обладают гормональными свойствами [47, 97].
Предполагают, что этилен, как и многие гормоны, влияет на функциональное состояние мембран, изменяя активность РНК полимеразы. Таким образом он может воздействовать на процессы транскрипции, особенно участков ДНК, ответственных за синтез долгоживущих мРНК, транскрибирующихся до мейоза, но необходимых для нормального течения мейотических процессов[58, 98].
'В результате возможных нарушений в синтезе различных форм PlHiK при включении гаметоцида в метаболизм клетки неизбежно возникают анормальности в синтезе белка. В нормально развивающейся спорогенной ткани и в микроспорах активный синтез белка приходится на раннюю мейотическую профазу, его активность несколько снижается в зиготене — пахитене и совсем незначительна в период формирования тетрад [101]. Тапетум как ткань проявляет очень высокую метаболическую активность в течение всего периода микроспо-рогенеза вплоть до полного автолиза, поэтому отводить тапе-туму только секреторную роль — значит ограничить его многообразные физиологические функции [108]. Отмечено, что пул ДНК тапетума недостаточен, чтобы служить источником для формирующихся микроспор [98]. Возможно, тапетум снабжает микроспоры растворимыми ДНК предшественниками,
14 как это было показано с экзогенно добавленным меченым ти-мидином, который быстро проникал в ткани тапетума и включался в ДНК микроспор [72]. Наиболее вероятно, что синтез РНК в тапетуме и микроспорах материнской клетки пыльцы независим. Однако это не исключает, что тапетум, особенно в ранний период формирования микроспор, частично поставляет предшественников РНК в спорогенную ткань [94]. В тапетуме имеется довольно большой рибосомальный пул, который, по-видимому, полностью деградирует вместе с ним или может поставлять предшественников РНК для последнего периода синтеза РНК в развивающихся спорах [101].

Роль тапетума в белковом синтезе может быть объяснена с точки зрения синтеза специфических энзимов, связаннь1х с мейозом или другими процессами в спорогенной ткани. Допустимо участие тапетума и в распределении белкового резерва. Высокая пропорция piPHK в его тканях свидетельствует о синтезе белков de novo, часть ,из которьгх откладывается как запасные в микроспорак
[28, 137]. Обработка гаметоцидными препаратами вызывает репрессию синтетических процессов белка в результате вмешательства этих физиологически активных веществ во взаимосвязь процессов ДНК— РНК—белок
[13, 19,29, 30, 104, 120]. Выяснение сущности процессов индукции мужской стерильности лежит в этой области. Эффект ГМК на ростовые процессы посредством действия ингибитора на обмен нуклеиновых кислот — экспериментально установленный факт [29]. Значительное влияние оказывает
ГМК на рибосомальную фракцию РНК путем изменений в процессах биосинтеза ДНК
[19]. Возможно, что специфичность действия ГМК проявляется на уровне репрессии синтеза биокаталитически активных белков именно той фракции, которая ответственна за синтез и распад ДНК. При воздействии ГМК наступает уменьшение фосфорелированных богатых лизином гистоновых фракций, количество которых в активноделящихся клетках при нормальных физиологических условиях значительно выше. Такое изменение в соотношении гистоновых фракций оказывает влияние на матричную активность ДНК, что приводит к нарушению мейотического цикла. Не исключено, что изменение соотношения форм гистонов под влиянием ГМК создает условия для атаки и расщепления ДНК'азой доступных участков ДНК, о чем свидетельствует возросшая активность этого энзима у растений, обработанных ГМК [19].

ГМК как гаметоцид не проявляет высокой селективности действия, так как параллельно оказывает влияние на мери-стематическую ткань, где стимулирует процессы распада и ингибирует синтетическую активность клеток [29].
Очевидно,

15
'этим объясняются негативные эффекты, наблюдаемые при опрыскивании растений растворами ГМК: задержка в росте и развитии, морфологические аномалии и т. д. [20, 125].

Изменения в деятельности центров, программирующих природу синтезируемых белков и регулирующих их синтез, при включении механизмов стерильности вызывают сложные сдвиги в ферментативных системах. Низкая активность различных энзиматшческих комплексов стерильных аналогов озимой пшеницы и угнетение активности окислительно-восстановительных процессов, лежащих в основе метаболизма, проявляются на ранних этапах формирования ,и развития микроспор [6, 128]. Дезорганизация в энзиматических системах вызывает дисбаланс в аминокислотном, углеводном и нуклеиновом пулах.

Хлорированные производные аляфатических карбоновых кислот, применяемые в качестве гаметощидов, вызывают накопление в тканях пыльников большого количества аминокислот (а-аланина, р-аланина, аспарагиновой, глутаминовой, се-рина и др.), одновременно резко снижается содержание про-лиаа [8, 26,
43].

При сравнительных исследованиях мужской стерильности у различных видов растений отмечены изменения в соотношении отдельных аминокислот в аминокислотном пуле. Количественный и качественный состав аминокислот обусловлены механизмами цитоплазматической регуляции и спецификой метаболизма растения. Так, в стерильных пыльниках сорго по сравнению с фертильными установлена анормальная акку^-муляция глицина и заниженное содержание аспарагиновой .кислоты, серина и аланина. М. W. Brooks, J. S.
Brooks и -L. Chien [52] считают, что в данном случае специфическим признаком, обусловливающим мужскую стерильность, является блокирование глицина в синтезе пурина. У других линий сорго с ЦМС обнаружено повышенное содержание трео-нина по сравнению с фертильными растениями. Пыльники последних включали больше аланина, глутаминовой кислоты и тирозина [43].
Вероятно, от типа стерильности и этапа, на котором возникают нарушения в синтетических процессах .клетки, зависит накопление или ингибирование образования определенных аминокислот.

.Сравнительные исследования содержания аминокислот у различных растений с разными формами мужской стерильности (функциональной, цитоплазматической и ядерной) показали, что во всех случаях было высокое содержание аспа-рагина' и низкое — пролина по сравнению с фертильными растениями [26, 43, 46].
Последующие эксперименты подтвер-

16

дили, что пыльники стерильных аналогов линий, полученных на основе цитоплазмы Т. timopheevi, характеризовались
-высоким содержанием свободного аспарагина и низким — пролина. Среди связанных аминокислот сохраняется та же закономерность [118].
^ Индукция мужской стерильности при использовании химических соединений, обладающих гаметоцидной активностью
'-(RMiK, FW-450 4- гиббереллин), сопровождалась аналогичными изменениями в аминокислотном пуле растений кукурузы: накоплением больших количеств a- алани'на, аспарагиновой
•и глутаминовой кислот, серина у стерилизованных растений с одновременным резким блокированием синтеза пролина [26]. Часть аспарагиновой кислоты подвергалась дальнейшему аминированию, что приводило к образованию амида, содержание которого у стерилизованных растений в отдельных случаях достигало 2%, или приблизительно половины от общей суммы всех свободных аминокислот [8]. Отмеченный многими авторами дефицит пролина у растений с различным типом мужской стерильности предполагает торможение синтеза белка путем включения механизмов мужской стерильности на более ранних этапах белоксинтетической системы (при синтезе аминокислот), в результате чего тормозятся процессы аминирования.

Полноценное питание в течение микроспорогенеза и развития пыльцы обусловливает нормальное развитие генеративных клеток. Массовое накопление свободного пролина начиналось после завершения мейоза, а в фазе тетрад он был обнаружен в заметных количествах [8]. Эта аминокислота принимает участие в ряде общих реакций метаболизма: активирует дыхание растительных тканей, регулирует поглощение кислорода, является донором NHz-групп при синтезе некоторых аминокислот и стимулирует синтез хлорофилла [8]. Про-лин относят к числу характерных аминокислот щелочных ядерных белков-гистонов и протаминов, несущих генетическую функцию в поддержании определенной структуры ДНК [9]. Влияние этой аминокислоты на активность генома связано с критическими этапами в развитии, когда незначительные структурные перестройки могут иметь решающее значение. Исключительно высокое содержание пролина в тканях гаме-тофита обусловливает определенную физиологическую
«нагрузку», которую он выполняет в процессах формирования пыльцы.

В пыльце диплоидных сортов содержание пролина в два раза выше, чем в пыльце триплоидных, имеющих пониженную трертильность [8]. Эти данные свидетельствуют, что пролин .занимает особое место среди других аминокислот при форми-2—10287 17 ровании пыльцы и, возможно, является определяющим метаболитом нормальных физиологических процессов.

Пролин пыльцы, по-видимому, вовлекается в самые ранние фундаментальные реакции гаметогенеза, и его дефицит в пыльниках может иметь прямое отношение к абортивности пыльцы. Содержание пролина начинает .снижаться на стадии мейоза и становится прогрессивным к периоду интерфазы микроспор, когда уже наблюдается дегенерация пыльцевого зерна. Дефицит пролина — это следствие некоторых дефектов в мейозе или в предшествующей стадии микроспорогене-за [118]. Параллельно накопление глутаминовой кислоты в стерильных пыльниках свидетельствует о торможении процессов превращения ее в пролин, предшественником которого она является. Относительно высокое содержание аспарагина в пыльниках растений с мужской стерильностью также обусловлено метаболическими отклонениями.

Индукция мужской стерильности вносит свои коррективы в биосинтетические процессы не только генеративных органов, но и всего растения. Общее содержание аминокислот в семенах и вегетативных органах стерильных растений пшеницы выше, чем фертильных, на 8%, что можно объяснить спецификой метаболической активности митохондрий стерильных растений [46, 63]. У нормально развивающихся растений накопление свободного пролина начинается после редукционного деления и осуществляется за счет притока пролина из вегетативных органов [8].

Наблюдения за изменениями в динамике развития организма, происходящими под влиянием веществ с гаметоцидной активностью во взаимосвязанной системе
ДНК—iPHiK—белок—аминокислоты, показали, что наиболее быстро и в значительной степени изменяются активности энзиматических систем, затем проявляются ответные реакции в обмене нуклеиновых кислот и белка и относительно с большим опозданием осуществляются процессы, приводящие к изменению соотношения свободных аминокислот, органических кислот и аммония
[98].

Многообразие действия хлорированных алифатических кислот на растительный организм предполагает возможность индуцирования мужской стерильности путем блокирования .разнообразных метаболических путей.

Попытки связать механизм избирательного действия были сделаны при изучении ряда хлорированных производных али-фатических карбоновых кислот, проявивших гаметоцидные свойства. Одним из предполагаемых механизмов селективного действия ар-дихлоризомасляной (FW-450) и трихлоруксус" ной
(ТХУ) кислот считают торможение ферментативного син-
18 теза пантотеновой кислоты из пантоевой и (3-аланина [20]. Физиологическая роль пантотеновой кислоты связана с тем, что она является функциональной группой конденсирующего фермента КоА. Хлорированные алифатические кислоты выступают антиметаболитами р-аланина, поэтому синтез цантотено-вой кислоты является одним из чувствительных метаболических путей к этой группе соединений. Действие FW-450 определяется конкуренцией с 2,4-диокси-р- метилмасляной кислотой за локус, специфически активирующий фермент.
Аналогичный эффект отмечен при действии 2, 3, 3-трихлормасляной к 2, 3- дихлормасляной кислот. Недостаток рибозы (одного из компонентов КоА) повышает токсичность FW-450 и этрела. Исследования гербицидного действия производных алифати-ческих карбоновых кислот показали, что эффект применяемых соединений обусловлен нарушением синтеза КоА. В результате возникает дисбаланс в соотношении ряда аминокислот трикарбонового цикла.
При этом снижается количество лимонной и возрастает содержание яблочной кислоты, происходит более интенсивный синтез р-аланина и аспарагиновой кислоты.

В настоящее время преждевременно судить об определенной специфичности действия конкретных гаметоцидов, о «месте первичного действия» соединения.
Возможно, механизм гаметоцидного действия определяется конкуренцией между веществом, обладающим гаметоцидньши свойствами, и определенными естественными метаболитами тканей генеративных органов.