Предыдущая страница реферата | 8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18 | Следующая страница реферата

Для нефелометрического метода чистую культуру Е. coli высевали на МПА и выращивали в термостате при температуре 37° С в течение 24 ч. Затем смывали стерильным изотоническим раствором хлористого натрия и стандартизовали до содержания в 1 мл 2 млрд. микробных тел. Из этой взвеси производили посев на МПБ в пробирки и сутки выращивали в термостате при вышеуказанной температуре.

Для определения бактерицидной активности сывороток крови мы использовали питательную среду (обогащенный пептоном бульон Хоттингера), содержащую 200 мг% амминного азота.

В стерильные кюветы с рабочей длиной 10 мм стерильной пипеткой разливали по 4,5 мл бульона Хоттингера, затем добавляли по 0,5 мл испытуемой сыворотки крови и суточную бульонную культуру Е. coli по одной бактериологической петле (диаметр петли 4 мм).

Контрольные кюветы заполняли теми же компонентами, что и опытные с той лишь разницей, что в один кювет вместо сыворотки добавили 0,5 мл стерильного изотонического раствора хлорида натрия. Содержимое всех кювет тщательно перемешивали стерильной стеклянной палочкой, после чего все кюветы закрывали ватно-марлевыми пробками. Оптическую плотность среды определяли на фотоэлектроколориметре ФЭК-М, используя зеленый светофильтр.
После этого кюветы ставили в термостат при температуре 37° С. Повторно определяли оптическую плотность содержимого кювет через 3, 5, 7, 9, 12 и 24 ч. Установку «0» на ФЭК-е производили с помощью кюветы, заполненной дистиллированной водой. Оценку бактерицидной активности сыворотки крови проводили по формуле:

А=100- [pic]Ч100,

Где: А — бактерицидная активность (в %);

Д — оптическая плотность;

Т — время экспозиции кювет в термостате (в часах).

Затем вычисляли среднюю «напряженность бактерицидной активности» (НБА) по формуле:

Средняя НБА = [pic],

Где: НБА — средняя напряженность бактерицидной активности молозивной сыворотки;

А1, А2, А3.....Аn — бактерицидная активность сыворотки молозива через 3,
5, 7, 9, 12 и 24ч (в %);

Т1, Т2, Т3....... Тn — продолжительность термостатирования (в часах).

2.1.11. Постановка опсонофагоцитарной реакции. При постановке опсонофагоцитарной реакции руководствовались методикой, описанной В. Я.
Мозгис (1982). Для приготовления антигена культуру Е. coli выдерживали в термостате при температуре 37° С в течение 18-24 ч в МПБ, а затем на МПА в течение 24 ч. Проверяли на чистоту и смывали стерильным изотоническим раствором хлорида натрия. По оптическому стандарту доводили концентрацию до
2-х млрд. микробных тел в 1 мл. Приготовленную взвесь нагревали в водяной бане при 70° С в течение 30 мин.

Для опсонофагоцитарной реакции применяли только суточную агаровую культуру Е. coli.

Исследования проводили в следующей последовательности. В пронумерованные стерильные пробирки наливали до 0,5 мл 2 % прокипяченного и охлажденного раствора лимоннокислого натрия, 1 мл крови от исследуемых телят и тщательно смешивали, сюда же вносили по 0,5 мл антигена. После осторожного перемешивания пробирки помещали в термостат при 38° С на 3 мин, предварительно погрузив их на 2-3 мин в водяную баню с температурой 38° С.
Затем пробирки из термостата извлекали, готовили мазки, сушили на воздухе, нумеровали, фиксировали в метиловом спирте в течение 5 мин и окрашивали по
Романовскому-Гимза.

Для приготовления рабочего раствора краски, дистиллированную воду усредняли фосфатными буферами: 1. Двухосновной фосфат натрия
(Na2HPO4Ч12H2O) — 17,814 г на 1 л (рН 8,302). 2. Одноосновной фосфат калия
(KH2PO4) — 13,638 г на 1 л (рН 4,529). Если к литру дистиллированной воды прибааляли по 5 см3 того и другого раствора, то рН такой воды был равен
6,813.

Краску готовили ex tempore из расчета 1,5 капли краски на 1 мл усредненной воды с рН 6,813. Мазки окрашивали в течение 45 мин, промывали водопроводной водой и высушивали на воздухе. Окрашенные мазки исследовали под иммерсионной системой микроскопа и окуляра 7Ч.

Подсчет фагоцитированных микробов производили в 100 нейтрофилах. На основе подсчета определяли фагоцитарную интенсивность (среднее число поглощенных микробов одним нейтрофилом) и фагоцитарную активность (процент фагоцитирующих нейтрофилов). С кровью подопытных животных поставили 450 реакций.

2.1.12. Определение содержания иммуноглобулинов в сыворотке крови, молозиве и молоке крупного рогатого скота.
Предварительно готовили фосфатный буфер 0,03М, рН 3,0. С этой целью 10,74 г натрия фосфорнокислого двух замещенного (Na2HPO4Ч12H2O) и 5,84 г хлорида натрия помещали в мерную колбу, растворяли в дистиллированной воде и доводили объем до 1 л. Подобным образом готовили раствор из 4,08 г однозамещенного фосфорнокислого калия (KH2PO4) и 5,84 г хлорида натрия.

Растворы под контролем потенциометра смешивали в соотношении обеспечивающим рН буфера 8,0.

Пробы сывороток крови получали путем выдержки взятой крови из яремной вены животных 20-30 мин при 37° С в термостате. После отделения образовавшегося сгустка от стенок пробирок стеклянной палочкой, кровь помещали на 16-20 ч в холодильник. На следующий день сыворотку отсасывали в стерильную центрифужную пробирку, центрифугировали 15-20 мин при 3000 об/мин.

Пробы молозива и молока после взятия выдерживали 16-20 ч при 4° С и центрифугировали в течение 1 ч при 6000 об/мин. Затем снимали верхний слой жира, отсасывали надосадочную жидкость, которую и использовали для определения.

Пластинки из 3 %-ного агара «Дифко», смешанного с антисывороткой готовили следующим образом: 360 мг агара помещали в колбу, заливали 12 мл буфера и прибавляли 0,25 мл 1 %-ного раствора мертиолата. Колбу помещали в баню с холодной водой, которую затем нагревали до кипения и выдерживали смесь до полного расплавления агара.

После расплавления гель охлаждали до 56° С и к нему приливали равный объем антисыворотки в рабочем разведении и снова нагревали до температуры
56° С. Смесь тщательно перемешивали и выливали на стекло, помещенное на столике с уровнем в строго горизонтальном положении.

Рекомендуем скачать другие рефераты по теме: реферат на тему школа, конспект зима.





Предыдущая страница реферата | 8  9  10  11  12  13  14  15  16  17  18 | Следующая страница реферата