Приложение № …

Описание некоторых лабораторно-практических работ, используемых при апробации спецкурса „Белок – основа жизни“.

I. Выделение белков из тканей и биологических жидкостей.

Цель: выявить содержание белков в тканях и биологических жидкостях.

1. Выделение казеина из молока.

Вариант I.

В химический стакан вместимостью 50 мл отмеривают цилиндром 3 мл молока и добавляют 7 мл дистиллированной воды. Смесь перемешивают и добавляют 10-15 капель 1%-ного раствора соляной кислоты. Кислоту приливают аккуратно, по каплям, так как в избытке кислоты осадок растворяется.
Суспензию перемешивают, через 3-5 минут образуется рыхлый осадок.

Для удаления соляной кислоты в стакан добавляют 10 мл дистиллированной воды, перемешивают и оставляют ещё на 5 минут. Жидкость осторожно сливают с осадка. К осадку ещё раз добавляют 10 мл дистиллированной воды, осторожно перемешивают содержимое стакана и через 5 минут фильтруют смесь через бумажный фильтр.

Доказательством того, что в состав казеина входит фосфор: осадок с фильтром переносят в широкую пробирку с обратным холодильником и добавляют
6 мл 10%-ного раствора гидроксида натрия. Пробирку нагревают на песчаной бане в течение 1 часа. Жидкости дают остыть и нейтрализуют её концентрированной азотной кислотой до слабокислой реакции на лакмус. При нейтрализации выпадает осадок высокомолекулярных продуктов неполного гидролиза белка.

После отстаивания жидкость фильтруют и с фильтратом проделывают биуретовую реакцию и молибденовую пробу на фосфорную кислоту. К 5 каплям гидролизата добавляют 10%-ый раствор NaOH и 2 капли 1%-ого раствора CuSO4.
Наблюдается фиолетовое окрашивание. К 10 каплям молибденового реактива добавляют 5 капель гидролизата и кипятят несколько минут. В присутствии
H3PO4 жидкость окрашивается в лимонно-жёлтый цвет. При охлаждении выпадает жёлтый кристаллический осадок комплексного соединения (NH4)3PO4(12MoO3.

Вариант II.

К 50-ти мл свежего молока добавляют равный объём насыщенного раствора сульфата аммония. При этом выпадают в осадок альбумины и казеин.
Отфильтровывают через складчатый бумажный фильтр раствор альбуминов.

2. Получение раствора яичного альбумина.

Осторожно проделывают отверстие в скорлупе яйца с двух концов и выливают белок в стакан вместимостью 500 мл. В тот же стакан добавляют 250 мл дистиллированной воды и содержимое стакана тщательно перемешивают стеклянной палочкой с резиновым наконечником.

Затем раствор переносят в мерный цилиндр, и объём раствора доводят до
300 мл добавлением дистиллированной воды. Раствор оставляют на 30 минут при комнатной температуре для образования хлопьевидного осадка глобулинов, затем разливают в пробирки по 20 мл.

20 мл полученной суспензии дважды фильтруют через складчатый фильтр.
Фильтрат, содержащий яичный альбумин, используют для дальнейшей работы.

3. Выделение белков мяса.

Помещают в стакан 40-50 г пропущенного через мясорубку обезжиренного мяса, добавляют 80-100 мл 10%-го раствора NaCl и оставляют смесь стоять 15-
20 минут при частом помешивании. Отфильтровывают через бумажный складчатый фильтр или через двойной слой марли окрашенную в красный цвет жидкость. В растворе содержатся главным образом, мышечный альбумин и глобулин.

4. Выделение растительных альбуминов.

25 грамм пшеничной муки смешивают со 100 мл дистиллированной воды, и смесь стряхивают в течение одного часа с помощью встряхивателя. Взвесь муки центрифугируют и надосадочную жидкость фильтруют через складчатый фильтр.
Отфильтрованный прозрачный раствор содержит преимущественно альбумин пшеничных зёрен.

II. Реакции осаждения белков.

Цель: выявить влияние различных органических и неорганических веществ на осаждение белков. Изучить физические свойства белков.

1. Осаждение белков концентрированными минеральными кислотами.

В три сухие пробирки наливают по 1-2 мл концентрированной HNO3, H2SO4,
HCl. Затем, наклонив каждую пробирку, осторожно по стенке добавляют из пипетки по 0,5 мл исследуемого раствора белка, так чтобы он не смешивался с кислотой. Вместе соприкосновения двух жидкостей появляется белый аморфный осадок белка. При встряхивании осадок, выпавший при действии HNO3, увеличивается, а осадки выпавшие при действии HCl и H2SO4, растворяются в их избытке.

Концентрированные минеральные кислоты вызывают необратимые осаждения белков. Это связано как с дегидратацией белковых молекул, так и с денатурацией белка.